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HIV蛋白酶抑制剂体外噬菌体筛选模型的建立及初步研究

作　者: 周波
导　师: 邓松华；潘卫
学　校: 安徽医科大学
专　业: 病理生理学
关键词: 人类免疫缺陷病毒-1 蛋白酶蛋白酶抑制剂筛选模型噬菌体展示
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

近年来，HIV感染在全球呈迅猛上升趋势，严重威胁着人类的健康。目前临床治疗AIDS主要运用高效抗逆转录病毒疗法(highly active anti-retroviral therapy，HAART)，可以明显减少AIDS相关发病率和死亡率。然而对一种或多种抗逆转录酶(RT)和蛋白酶抑制剂(PI)药物耐药的HIV变异株的出现是影响HAART治疗效果的主要因素。由于尚无有效的HIV疫苗问世，因此开发新一代的HIV蛋白酶抑制剂就具有更加紧迫的现实意义。本研究拟应用噬菌体展示技术，构建针对HIV蛋白酶(PR)的适用于PI药物大规模初筛的噬菌体体外筛选模型。本研究分为三个部分：首先体外构建高效的原核表达载体，在大肠杆菌中表达、纯化HIV-1型HXB2株PR的底物之一核壳蛋白(capsid，CA)与P2蛋白的融合蛋白CAP2，用于体外研究PR生物学功能；其次用HIV SF2 PR切割靶蛋白CAP2NC和含固相化标记的重组蛋白LD3-CAP2NC及其噬菌体表面展示蛋白，并体外使用蛋白酶抑制剂(PI)抑制其切割作用；最后对HIV-lPR靶蛋白CAP2和NC之间切割位点进行了随机化并构建其噬菌体展示文库并用HIV PR对改文库进行筛选。一、HIV-1型HXB2株PR靶蛋白CAP2在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定根据HIV-1 HXB2株PR靶蛋白CAP2的DNA序列设计引物，用重叠延伸PCR方法合成使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1PR的DNA编码序列，用T／A克隆法将其插入pMD18-T载体进行测序。将HIV-1 CAP2 DNA克隆至原核表达载体PET32a(+)，在大肠杆菌BL21-TRXB中进行诱导表达，用Ni-NTA亲和柱对表达蛋白进行纯化，SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物，并用HIV阳性血清进行免疫反应性的鉴定。序列测定显示其编码氨基酸序列与原始序列完全一致。所构建的HIV-1 PR原核表达质粒PET32a(+)，经IPTG诱导后，表达出相对分子质量为26000的HIV-1 PR蛋白，纯化的目的蛋白浓度为6.65mg／ml。ELISA检测证实该蛋白与HIV阳性血清呈特异性的反应。

全文目录

英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-10
ABSTRACT  10-12
前言  12-15
第一部分 HIV-1 HXB2株蛋白酶靶蛋白CAP2在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定  15-28
  1 材料  15-18
  2 方法  18-21
  2 结果  21-25
  3 讨论  25-28
第二部分噬菌体展示HIV靶蛋白体外蛋白酶切割模型的构建  28-35
  1 材料和方法  28-30
  2 结果  30-33
  3 讨论  33-35
第三部分 HIV-1 GAG蛋白P2／NC蛋白酶切割位点序列随机化的噬菌体展示及筛选  35-48
  1 材料和方法  35-41
  2 结果  41-46
  3 讨论  46-48
参考文献  48-51
总结  51-52
个人简历  52-53
致谢  53-55
综述  55-62

HIV蛋白酶抑制剂体外噬菌体筛选模型的建立及初步研究

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