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中华真地鳖（Eupolyphaga sinensis）抗肿瘤蛋白分离纯化及其体外抗转移活性研究

作　者: 王凤霞
导　师: 吉爱国
学　校: 山东大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 中华真地鳖 抗肿瘤蛋白 分离纯化 抗肿瘤转移 分子机制 β1-整合素 人肺癌细胞株A549
分类号: R284.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


中华真地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker),俗称土鳖、土元等,属于蜚蠊目(Blattodea),鳖蠊科(Corydiidae),地鳖亚科(Polyphaginae),真地鳖属(Eupolyphaga)昆虫,目前已实现大规模人工养殖。中华真地鳖作为一种传统中药,在我国具有悠久的药用历史。现代研究表明,中华真地鳖具有溶解血栓、抗凝血、抗肿瘤、促进骨折愈合、调节血脂等十分广泛的药理作用。对于中华真地鳖的研究,国外学者很少涉及,其研究近乎空白。近年来,国内学者研究表明中华真地鳖蛋白提取物能够抑制血管生成和肿瘤生长。可见,蛋白组分被认为是中华真地鳖的抗肿瘤有效组分。但是,到目前为止,尚未见中华真地鳖抗肿瘤蛋白成分的报导。我们利用现代生化分离技术,从中华真地鳖新鲜雌虫体中分离纯化得到一分子质量约为72kDa的抗肿瘤蛋白,命名为EPS72。该蛋白对人肝癌细胞株Bel-7402、肺癌细胞株A549等多种人癌细胞株表现出较强的增殖抑制作用。以A549细胞作为体外肿瘤模型,研究了EPS72对细胞形态、增殖、凋亡、粘附、伸展、迁移以及侵袭的影响,发现EPS72具有体外抗肿瘤转移活性,并初步探讨了EPS72体外抗肿瘤转移可能的分子机制。期望为EPS72进一步开发利用提供一定的线索,同时为抗肿瘤蛋白类药物的研究提供一些新的思路。本课题的主要研究内容及结果有以下几个方面：1中华真地鳖抗肿瘤蛋白的提取、纯化及鉴定首先采用硫酸铵分级沉淀(50%-80%饱和度)、超滤(截留分子质量为10kDa)和冷冻干燥技术获得蛋白粗提物(组分Ⅰ)。由组分Ⅰ得到抗肿瘤活性蛋白的纯化方案由捕获、中度纯化和精制三个步骤组成：(1)捕获：分别采用CM-Sepharose FF阳离子交换色谱和DEAE-Sepharose FF阴离子交换色谱对抗肿瘤有效活性组分进行捕获；(2)中度纯化：分别采用Q-Sepharose HP阴离子交换色谱和Butyl Sepharose HP疏水色谱进行中度纯化；(3)精制：采用Superdex75凝胶过滤色谱进行精制。整个纯化过程中采用280nm检测蛋白质洗脱情况,分别收集各洗脱峰,采用MTT法追踪抗肿瘤活性组分,最后得到的活性组分进行冷冻干燥即为纯化所得抗肿瘤蛋白(组分Ⅵ)。每1kg新鲜活虫材料大约可得到电泳纯的抗肿瘤蛋白56mg,蛋白得率0.0056%。活性组分Ⅵ在SDS-PAGE上显示为单一条带,表观分子质量约为72kDa,表明其达到了电泳纯;MALDI-TOF质谱结果表明其分子质量为71.737kDa,与SDS-PAGE结果基本吻合,说明纯化得到的抗肿瘤蛋白为单链蛋白,分子量约为72kDa,故命名为EPS72。2EPS72体外抗肿瘤活性研究MTT存活分析表明EPS72对肝癌Bel-7402细胞、肺癌A549细胞等多种人癌细胞株表现出较强的增殖抑制作用。接着以A549细胞作为体外肿瘤模型,研究了EPS72对细胞形态、凋亡、粘附、伸展、迁移以及侵袭的影响。相差显微镜下细胞形态学研究、台盼蓝染色计数、AO/EB染色以及JC-1检测细胞膜电位(△Ψm)结果表明,EPS72作用早期可诱导已贴壁生长的肿瘤细胞脱粘附,但是刚脱粘附细胞为胞膜完整的活细胞,撤药后能正常生长,而脱粘附细胞持续受药物作用后则会进一步诱导细胞凋亡性死亡。可见,EPS72诱导肿瘤细胞脱粘附的作用是直接的,而诱导细胞凋亡的作用是间接的。细胞粘附实验进一步表明,EPS72能够显著抑制肿瘤细胞向细胞外基质(ECM)蛋白成分纤粘连蛋白(fibronectin,FN)和Ⅳ型胶原蛋白(collagen Ⅳ,Col Ⅳ)的粘附,但对细胞向非ECM成分多聚赖氨酸(poly-L-lysine, PL)的粘附却没有影响。癌细胞体外伸展实验结果表明,EPS72能够抑制肿瘤细胞在ECM表面上伸展。创伤愈合实验表明EPS72能够阻止肿瘤细胞向创伤面迁移。Transwell实验进一步证明EPS72能够影响肿瘤细胞向Matrigel的侵袭能力。可见,EPS72通过影响肿瘤细胞的粘附、伸展、转移、侵袭及增殖、存活能力发挥体外抗肿瘤作用,EPS72具有体外抗肿瘤转移活性。3EPS72体外抗肿瘤作用的分子机制为了进一步探讨EPS72体外抗肿瘤转移的分子机制,利用荧光显微镜采用免疫荧光法研究了EPS72对细胞肌动蛋白骨架成分F-actin的影响；采用流式细胞仪和Western blotting技术研究了EPS72作用后肿瘤细胞β1-整合素和整合素关联蛋白激酶(ILK)表达情况。结果表明,EPS72作用后F-actin的聚合受到抑制,肿瘤细胞p1-整合素和ILK的表达受到抑制,推测EPS72可能通过直接靶向肿瘤细胞表面的β1-整合素,进而影响整合素—细胞骨架信号通路发挥体外抗肿瘤转移作用。本研究取得的成果和结论主要有：(1)采用现代生化分离技术,首次从中华真地鳖新鲜雌虫体中分离纯化得到一种分子量约为72kDa的抗肿瘤蛋白,命名为EPS72。该分离纯化工艺条件温和,操作简单,并易于规模化放大生产。(2)体外研究表明,EPS72对人肝癌Bel-7402细胞、肺癌A549细胞等人癌细胞株表现出较强的胞毒活性,而对非癌细胞株MRC5的细胞毒性较低,显示该活性蛋白具有较强的广谱抗肿瘤活性,且对肿瘤细胞显示出良好的选择性。(3)确定了EPS72通过影响肿瘤细胞的粘附、伸展、转移、侵袭及增殖、存活能力发挥体外抗肿瘤作用,EPS72具有体外抗肿瘤转移能力。(4)初步推测EPS72可能通过直接靶向肿瘤细胞表面的β1-整合素,进而影响整合素—细胞骨架信号通路发挥体外抗肿瘤转移作用。

全文目录


中文摘要  16-19
ABSTRACT  19-23
符号说明  23-25
第一章 前言  25-48
  1 抗肿瘤药物研发战略  25-28
    1.1 新的细胞毒类药物  25-27
    1.2 新靶点抗肿瘤药物研究  27-28
  2 整合素与肿瘤转移  28-37
    2.1 整合素结构  28-30
    2.2 整合素在肿瘤转移过程中的作用  30-37
      2.2.1 整合素对细胞存活的作用  32
      2.2.2 整合素对细胞迁移的影响  32-33
      2.2.3 整合素调节血管生成  33-34
      2.2.4 整合素对肿瘤入侵与转移的影响  34
      2.2.5 ECM—整合素相互作用成为癌症治疗的重要靶点  34-37
        2.2.5.1 整合素抑制剂  34-36
        2.2.5.2 基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂  36-37
  3 动物毒素的抗肿瘤作用  37-40
    3.1 斑蝥素(cantharidin,CA)  37
    3.2 多肽、蛋白质或酶类  37-40
      3.2.1 蛇毒素去整合素(Disintegrins)  38
      3.2.2 蝎毒素Chlorotoxin(Cltx)  38-39
      3.2.3 蜂毒素(Melittin)  39
      3.2.4 海鞘多肽Didemnin B  39-40
      3.2.5 海兔多肽Dolastatin  40
      3.2.6 海兔蛋白Cyplasin  40
  4 中华真地鳖化学成分及药理作用研究进展  40-46
    4.1 中华真地鳖活性成分  41-43
      4.1.1 蛋白质(酶)和氨基酸  41-42
        4.1.1.1 氨基酸  41-42
        4.1.1.2 纤溶活性成分  42
        4.1.1.3 抗肿瘤活性蛋白成分  42
      4.1.2 脂肪酸  42-43
      4.1.3 生物碱  43
      4.1.4 脂溶性维生素和无机元素  43
      4.1.5 高级醇及其衍生物  43
      4.1.6 其他成分  43
    4.2 中华真地鳖的药理作用  43-46
      4.2.1 对心血管系统的影响  44-45
        4.2.1.1 抗凝血和抗血栓作用  44
        4.2.1.2 调节血脂、抗氧自由基及保护血管内皮细胞的作用  44
        4.2.1.3 对血液流变性作用  44-45
        4.2.1.4 抗缺血缺氧  45
      4.2.2 抑制血管生成及抗肿瘤活性  45
      4.2.3 抗突变作用  45-46
      4.2.4 治疗骨折创伤作用  46
      4.2.5 对免疫系统的影响及抗氧化作用  46
      4.2.6 其他作用  46
  5 本课题研究的目的和意义  46-48
第二章 中华真地鳖抗肿瘤蛋白分离纯化及鉴定  48-72
  1 材料  48-51
    1.1 实验材料及细胞  48-49
    1.2 主要仪器设备及耗材  49-50
    1.3 酶及主要试剂  50-51
  2 实验方法  51-60
    2.1 中华真地鳖抗肿瘤蛋白的分离纯化  51-55
      2.1.1 蛋白粗提物的制备  51
      2.1.2 抗肿瘤蛋白的纯化  51-54
        2.1.2.1 CM-Sepharose FF弱阳离子交换色谱  51-52
        2.1.2.2 DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换色谱  52-53
        2.1.2.3 Q-Sepharose HP强阴离子交换色谱  53
        2.1.2.4 Butyl Sepharose HP疏水相互作用色谱  53-54
        2.1.2.5 Superdex 75凝胶过滤色谱  54
      2.1.3 中华真地鳖抗肿瘤蛋白提取纯化流程  54-55
    2.2 BCA法测定蛋白浓度  55-56
    2.3 细胞培养  56-57
    2.4 MTT法检测蛋白组分体外抗肿瘤活性  57-58
    2.5 中华真地鳖抗肿瘤蛋白鉴定  58-60
      2.5.1 SDS-PAGE鉴定蛋白纯度和表观分子量  58-60
      2.5.2 质谱法测定分子质量  60
    2.6 统计学处理  60
  3 结果  60-67
    3.1 中华真地鳖抗肿瘤蛋白的分离纯化  60-65
      3.1.1 CM-Sepharose FF阳离子交换色谱结果  60-61
      3.1.2 DEAE-Sepharose FF阴离子交换色谱结果  61-62
      3.1.3 Q-Sepharose HP阴离子交换色谱结果  62-63
      3.1.4 Butyl SepharoseHP疏水色谱结果  63-64
      3.1.5 Superdex 75凝胶过滤色谱结果  64-65
    3.2 中华真地鳖抗肿瘤蛋白鉴定  65-66
      3.2.1 SDS-PAGE结果  65
      3.2.2 MALDI-TOF-MS结果  65-66
    3.3 中华真地鳖抗肿瘤蛋白得率  66
    3.4 分离纯化过程中各活性组分体外抗肿瘤活性检测  66-67
  4 讨论  67-71
  5 本章小结  71-72
第三章 中华真地鳖抗肿瘤蛋白EPS72体外抗肿瘤方式研究  72-96
  1 材料  72-74
    1.1 细胞系  72
    1.2 主要仪器设备及耗材  72-73
    1.3 酶及主要试剂  73-74
    1.4 主要试剂的配制  74
  2 实验方法  74-81
    2.1 细胞培养  74
    2.2 MTT存活分析  74-75
      2.2.1 EPS72抗瘤谱分析  75
      2.2.2 EPS72对A549细胞增殖的影响  75
    2.3 细胞形态学观察  75
    2.4 台盼蓝染色计数  75-76
    2.5 JC-1检测线粒体膜电位(△Ψm)  76-77
    2.6 AO/EB双荧光染色  77-78
    2.7 细胞—基质粘附实验  78-79
    2.8 细胞伸展实验  79-80
    2.9 细胞迁移实验  80
    2.10 细胞侵袭实验  80-81
    2.11 统计学处理  81
  3 结果  81-93
    3.1 EPS72对体外培养肿瘤细胞及正常细胞的胞毒作用  81-83
    3.2 EPS72对A549细胞增殖与存活的影响  83-84
    3.3 EPS72对A549细胞形态学的影响  84-85
    3.4 脱粘附细胞存活状态检测  85-86
      3.4.1 台盼蓝染色结果  85-86
      3.4.2 撤药重培养结果  86
    3.5 EPS72进一步诱导A549细胞凋亡  86-89
      3.5.1 JC-1检测线粒体膜电位(△Ψm)结果  86-88
      3.5.2 AO/EB荧光染色结果  88-89
    3.6 EPS72对A549细胞粘附的影响  89-90
    3.7 EPS72对A549细胞伸展能力的影响  90-92
    3.8 EPS72对肿瘤细胞迁移能力的影响  92
    3.9 EPS72对肿瘤细胞侵袭能力的影响  92-93
  4 讨论  93-95
  5 本章小结  95-96
第四章 中华真地鳖抗肿瘤蛋白EPS72体外抗肿瘤作用分子机制的初步研究  96-110
  1 材料  96-98
    1.1 细胞系  96
    1.2 主要仪器设备及耗材  96-97
    1.3 酶及主要试剂  97-98
  2 实验方法  98-104
    2.1 微丝F-actin免疫荧光染色  98-99
    2.2 流式细胞仪检测β1-整合素的表面表达  99
    2.3 Western blotting分析β1-整合素和ILK细胞内表达情况  99-104
    2.4 统计学分析  104
  3 结果  104-107
    3.1 EPS72诱导F-actin解聚  104-105
    3.2 EPS72影响β1-整合素和ILK表达  105-107
  4 讨论  107-109
  5 本章小结  109-110
总结与展望  110-112
  1 本研究的主要结论  110
  2 展望  110-112
参考文献  112-128
Article  128-136
致谢  136-137
博士期间发表的论文  137-138
学位论文评阅及答辩情况表  138

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学 > 有效成分的分离与提取
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