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鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立

作　者: 张倩
导　师: 刘永杰
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 单链抗体 可变区 嗜水气单胞菌 间接ELISA IgM
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


鱼类的免疫系统在抵御病原入侵及感染后疾病的恢复上起到了关键作用。其中,IgM是鱼类特异性免疫应答中最主要的介质。目前,血清抗体效价的高低已经成为反映水生动物免疫水平较为理想和可靠的指标。因此,建立检测鱼类血清中IgM的方法,对于深入了解鱼类体液免疫应答的规律,有效监测鱼类疫苗的免疫效果及疾病的感染情况有着重要的意义。单链抗体(scFv)是将抗体的重链、轻链可变区通过一条弹性肽链连接物(Linker)首尾相接组成的重组蛋白,保持着天然抗体的特异性和大致接近的亲和力。其具有分子量小、易于基因工程改造、便于大量生产等优点,因此比完整长度的单克隆抗体具有更大的优势和发展前景。本试验对实验室制备和保存的小鼠抗鲫鱼IgM单克隆抗体(mAb)进行了单链抗体的构建。以mAb F3a为研究对象,利用Trizol法提取F3a的总RNA,反转录合成cDNA后,利用PCR方法扩增重链、轻链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR方法将重链、轻链通过Linker连接起来构建F3a-scFv,并将其插入原核表达载体pET32a(+)中构建重组质粒,经测序正确后,阳性克隆转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,目的蛋白大小在45kDa左右,主要以包涵体形式存在。对表达产物应用Ni-NST His-Bind Resin进行纯化后,进行脲梯度透析复性,并对其进行超滤浓缩,得到目的蛋白浓度为2.6mg/mL。间接ELISA和Western blotting证实F3a-scFv复性后具有良好的免疫反应性。为了有效地监测鱼类疫苗的免疫效果及疾病的感染情况,本试验以灭活嗜水气单胞菌为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鲫鱼IgM的单链抗体为酶标二抗,通过反应条件的优化建立了检测鲫鱼血清中IgM抗体水平的间接ELISA方法。实验所确定的间接ELISA最佳反应条件为：包被抗原最适工作浓度为108cfu/mL,最佳包被条件是4℃过夜；一抗(血清)最佳稀释度为1：160;最佳封闭条件是以5%脱脂奶,37℃封闭1.5h;抗原抗体最佳作用时间为1.5h;酶标二抗最佳作用稀释度为1：50,作用时间为1h;TMB底物显色条件为28℃温育10min。以OD450值>0.0963判为阳性,样品OD450值<0.0831时判为阴性,0.0831≤品OD值<0.0963时判定为可疑。敏感性试验显示当血清稀释度达1：2560时,阳性样品检测结果仍为阳性,表明所建立的间接ELISA方法敏感性较好。批次内重复性试验的变异系数在1.2%-5.3%之间,批次间重复性试验的变异系数在1.36%-6.7%之间,均小于10%,表明所建立的间接ELISA方法重复性和稳定性良好。运用已建立的间接ELISA方法检测鲫鱼不同免疫和感染时期血清中IgM抗体的水平,结果显示：免疫组和感染组10d前的血清抗体水平均为阴性,10d开始呈现上升趋势,免疫组在35-40d时血清IgM抗体水平达到最高,而感染组在30-35d时达到最高,此后两组的血清IgM抗体水平开始下降；直到60d时,免疫组IgM抗体水平仍较高,而感染组检测结果也仍为阳性。与感染组和免疫组相比,对照组所有时间点的检测结果皆为阴性。

全文目录


摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
第一篇 文献综述  14-34
  第一章 嗜水气单胞菌检测技术研究进展  14-24
    1 嗜水气单胞菌概况  14-15
      1.1 嗜水气单胞菌生物学特性  14
      1.2 嗜水气单胞菌血清学分型  14
      1.3 嗜水气单胞菌致病因子  14-15
      1.4 嗜水气单胞菌流行病学及病症  15
    2 嗜水气单胞菌检测技术  15-19
      2.1 常规生化鉴定方法  15-16
      2.2 选择性培养基  16
      2.3 分子生物学检测方法  16-17
        2.3.1 聚合酶链式反应  16
        2.3.2 基因芯片  16-17
        2.3.3 核酸探针技术  17
      2.4 免疫学技术  17-18
        2.4.1 SPA协同凝集试验  17
        2.4.2 免疫荧光技术  17-18
        2.4.3 酶联免疫吸附试验  18
      2.5 其他方法  18-19
    3 结语  19-20
    参考文献  20-24
  第二章 单链抗体的制备技术及应用发展  24-34
    1 抗体的分子结构  24
    2 单链抗体的结构  24-25
    3 单链抗体的特点和改造类型  25
      3.1 单链抗体的特点  25
      3.2 单链抗体的改造类型  25
    4 单链抗体的基因来源  25
    5 单链抗体的表达系统  25-27
      5.1 原核细胞表达系统  25-26
      5.2 真核细胞表达系统  26-27
        5.2.1 酵母表达系统  26
        5.2.2 哺乳动物细胞表达系统  26-27
        5.2.3 昆虫细胞表达系统  27
        5.2.4 植物细胞表达系统  27
    6 单链抗体在动物疾病研究中的应用  27-29
      6.1 应用于靶向载体  27-28
      6.2 应用于抑制病毒复制  28
      6.3 应用于病原菌检测  28
      6.4 应用于体内寄生虫的防治  28-29
    7 单链抗体技术发展存在的问题  29-30
    参考文献  30-34
第二篇 试验研究  34-76
  第三章 鲫鱼IGM单链抗体融合基因的构建和表达  34-60
    摘要  34
    1 实验材料  34-35
      1.1 菌种与载体  34-35
      1.2 细胞株  35
      1.3 主要试剂  35
      1.4 主要仪器设备  35
    2 实验方法  35-47
      2.1 杂交瘤细胞株的复苏  35
      2.2 杂交瘤细胞的亚克隆  35-36
        2.2.1 饲养细胞的制备  35-36
        2.2.2 有限稀释法筛选  36
      2.3 杂交瘤细胞总RNA的提取  36-37
      2.4 反转录合成cDNA  37
      2.5 可变区基因的克隆及鉴定  37-40
        2.5.1 引物设计  37-38
        2.5.2 单克隆抗体可变区基因的扩增  38
        2.5.3 PCR产物凝胶电泳回收与纯化  38-39
        2.5.4 PCR产物连接转入T-vector  39
        2.5.5 DH5α感受态细胞的制备  39
        2.5.6 重组质粒转化大肠杆菌DH5α  39-40
        2.5.7 菌液PCR鉴定  40
        2.5.8 质粒的小量制备  40
      2.6 单链抗体基因(F3a-scFv)的构建  40-43
        2.6.1 拼接F3a-scFv基因的引物设计与合成  40-41
        2.6.2 重链可变区DNA的准备  41-42
        2.6.3 轻链可变区DNA的准备  42
        2.6.4 重叠延伸PCR拼接F3a-scFv全长基因  42-43
        2.6.5 构建19T/F3a-scFv重组质粒并转化大肠杆菌DH5α  43
        2.6.6 菌液PCR鉴定并送测序  43
        2.6.7 质粒的小量制备  43
      2.7 pET 32a-F3a-scFv重组表达载体的构建  43-44
        2.7.1 原核表达载体pET 32a(+)与重组克隆抗体F3a-scFv的限制性内切酶消化及胶回收  43
        2.7.2 连接反应  43-44
        2.7.3 重组质粒转化大肠杆菌DH5α  44
        2.7.4 阳性克隆质粒的提取及酶切鉴定  44
      2.8 pET32a-F3a-scFv融合蛋白的原核表达  44-46
        2.8.1 感受态细胞BL21(DE3)的制备及重组质粒pET32a-F3a-scFv的转化  44
        2.8.2 pET32a-F3a-scFv融合蛋白的诱导表达  44-46
      2.9 F3a-scFv生物学活性分析  46
        2.9.1 Western Blotting检测F3a-scFv复性蛋白  46
        2.9.2 间接ELISA法鉴定F3a-scFv的活性  46
      2.10 F3a-scFv酶标抗体的制备  46-47
    3 结果  47-54
      3.1 杂交瘤细胞的亚克隆与抗体亚类  47
      3.2 杂交瘤细胞总RNA的提取与反转录合成cDNA  47
      3.3 可变区基因V_L、V_H的扩增  47
      3.4 重组质粒pMD 19T/X的筛选(X为克隆的目的片段)  47-48
      3.5 可变区基因的测序结果  48-49
      3.6 单链抗体基因(F3a-scFv)的构建  49-51
        3.6.1 V_H-Linker和Liner-V_L的扩增  49-50
        3.6.2 F3a-scFv全长基因的拼接  50
        3.6.3 测序结果分析  50-51
      3.7 pET 32a-F3a-scFv重组表达载体的构建  51-52
      3.8 pET 32a-F3a-scFv融合蛋白的诱导表达  52-53
      3.9 F3a-scFv抗原结合活性  53-54
        3.9.1 F3a-scFv与鲫鱼IgM的Western Blotting结果分析  53-54
        3.9.2 间接ELISA测定F3a-scFv的活性  54
      3.10 F3a-scFv酶标抗体的制备  54
    4 讨论  54-58
      4.1 scFv基因的构建  55
      4.2 scFv的表达  55-56
      4.3 scFv基因序列分析  56
      4.4 scFv蛋白的纯化、复性和浓缩  56-57
      4.5 scFv活性的测定  57-58
    参考文献  58-59
    ABSTRACT  59-60
  第四章 嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立  60-76
    摘要  60-61
    1 实验材料  61
      1.1 实验动物及菌株  61
      1.2 主要试剂及实验仪器  61
    2 实验方法  61-65
      2.1 全菌抗原的制备  61-62
      2.2 血清的制备  62
        2.2.1 阳性血清的制备  62
        2.2.2 阴性血清的制备  62
        2.2.3 不同免疫时期鲫鱼免疫血清的制备  62
        2.2.4 不同感染时期鲫鱼免疫血清的制备  62
      2.3 间接ELISA实验操作步骤  62-63
        2.3.1 全菌包被抗原的制备  62-63
        2.3.2 包被  63
        2.3.3 封闭  63
        2.3.4 加鱼血清(一抗)  63
        2.3.5 加HRP-scFv(二抗)  63
        2.3.6 显色和终止  63
        2.3.7 结果判定  63
      2.4 间接ELISA最佳反应条件的选择  63-65
        2.4.1 包被抗原和一抗最佳工作浓度的选择  63-64
        2.4.2 抗原最适包被条件的选择  64
        2.4.3 封闭液和封闭时间的选择  64
        2.4.4 一抗血清最佳反应时间的选择  64
        2.4.5 酶标二抗最佳稀释度和作用时间的选择  64
        2.4.6 显色时间的确定  64
        2.4.7 Cut-off值的确定  64-65
      2.5 敏感性试验  65
      2.6 重复性试验  65
        2.6.1 批次内重复性试验  65
        2.6.2 批次间重复性试验  65
      2.7 不同免疫及感染时期鲫鱼IgM抗体水平的检测  65
    3 结果  65-71
      3.1 间接ELISA最佳反应条件的选择  65-69
        3.1.1 包被抗原和一抗最佳工作浓度的确定  65-66
        3.1.2 抗原最适包被条件的确定  66
        3.1.3 封闭液和封闭时间的确定  66-67
        3.1.4 一抗血清最适作用时间的确定  67
        3.1.5 酶标二抗最佳稀释度和作用时间的选择  67-68
        3.1.6 显色时间的确定  68
        3.1.7 Cut-off值的确定  68-69
      3.2 敏感性试验  69
      3.3 重复性试验  69-70
        3.3.1 批次内重复性试验  69-70
        3.3.2 批次间重复性试验  70
      3.4 不同免疫及感染时期鲫鱼血清抗体水平的检测  70-71
    4 讨论  71-73
    参考文献  73-74
    ABSTRACT  74-76
全文总结  76-78
致谢  78

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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