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柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2（EtSir2）功能的初步研究

作　者: 鄢远会
导　师: 杨亮宇
学　校: 云南农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 柔嫩艾美耳球虫 沉默信息调节因子2 基因克隆 重组表达 酶动力学 抑制动力学
分类号: S852.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


鸡球虫病是由寄生性原虫引起的，严重危害集约化养鸡业生产的最主要疫病之一。目前鸡球虫病的控制仍主要依赖药物，但严重的抗药性使球虫病的控制受到前所未有的挑战[1]，迫切需要新球虫药物面市。近年来，基于药靶有目的性地进行药物设计成为当今药物创制的主流方法，而明确靶蛋白的功能、以及通过X射线衍射解析药靶结构和作用机理是设计和合成新型药物的基础。沉默信息调节因子2（silent information regulator2，Sir2）在染色质沉默、代谢调节和抗原变异等生命活动中发挥重要作用，被认为是研制新型抗感染性药物的潜在药物靶标，迄今尚未有关于球虫Sir2的相关研究报道。研究选取对临床危害最为严重的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella，E.tenella）为研究对象。应用生物信息学和比较基因组学技术注释获得了E.tenella的Sir2基因序列并设计引物，以E.tenella第二代裂殖子cDNA文库为模板， PCR扩增EtSir2ORF基因序列。构建pET43a-EtSir2重组表达载体，原核表达并纯化后进行酶动力学及抑制动力学分析。结果显示，EtSir2ORF全长909bp，编码一段全长302个氨基酸的胞浆蛋白。种间相似性为24%～58%，与刚地弓形虫和犬新孢子虫进化关系最为接近。EtSir2分子质量约为99ku，以可溶性蛋白形式表达。最佳反应条件下EtSir2对NAD+的Km=41.7μM，Vmax=0.07349mmol/min/mg，对Ac-peptide的Km=51.2μM，Vmax=0.1093mmol/min/mg。先导化合物：尼克酰胺（Nicotinamide，NAM）能够抑制EtSir2的活性，其IC50值为355μM。该研究结果为EtSir2作为抗球虫药物靶标，研制新型抗球虫药物提供了理论和实验基础。

全文目录


目录  3-6
摘要  6-7
Abstract  7-9
1 引言  9-15
  1.1 国内外研究进展  9-14
    1.1.1 鸡球虫病概述及其防治现状  9-10
    1.1.2 Sir2 基因序列及蛋白结构特征  10-12
    1.1.3 Sir2 的功能  12-13
    1.1.4 Sir2 的催化机制  13-14
  1.2 研究目的及意义  14-15
2 材料与方法  15-46
  2.1 柔嫩艾美耳球虫 Sir2 基因的注释与克隆  15-22
    2.1.1 材料  15-17
    2.1.2 方法  17-22
  2.2 柔嫩艾美耳球虫 EtSir2 的重组表达及 Western blot 分析  22-37
    2.2.1 材料  22-27
    2.2.2 方法  27-37
  2.3 EtSir2 酶动力学与抑制动力学分析  37-46
    2.3.1 材料  37-39
    2.3.2 方法  39-46
3 结果  46-74
  3.1 柔嫩艾美耳球虫 EtSir2 基因的注释与克隆  46-56
    3.1.1 EtSir2 基因的注释  46-47
    3.1.2 PCR 扩增 EtSir2 全长 ORF 序列  47
    3.1.3 最适 PCR 反应条件  47-48
    3.1.4 PCR 产物的分离、回收和鉴定  48-49
    3.1.5 PCR 法鉴定转化克隆  49
    3.1.6 EtSir2 序列比对  49-51
    3.1.7 信号肽分析  51-52
    3.1.8 亚细胞定位的预测  52-53
    3.1.9 跨膜结构域分析  53-54
    3.1.10 多重序列比对及进化树分析  54-56
    3.1.11 模拟 3D 空间构象  56
  3.2 柔嫩艾美耳球虫 EtSir2 的重组表达及 Western blot 分析  56-65
    3.2.1 PCR 扩增带酶切位点的 EtSir2 序列  56-57
    3.2.2 双酶切目的基因与载体  57-58
    3.2.3 PCR 法鉴定转化克隆  58-59
    3.2.4 双酶切鉴定 PCR 阳性克隆  59-60
    3.2.5 PCR 法鉴定重组表达质粒转化的表达菌  60-61
    3.2.6 不同诱导条件对 EtSir2 表达量的影响  61-64
    3.2.7 EtSir2 的 Ni-NTA 蛋白纯化  64
    3.2.8 凝胶色谱法分离 EtSir2 以及免疫印迹分析  64-65
  3.3 柔嫩艾美耳球虫 EtSir2 酶动力学分析  65-74
    3.3.1 BSA 标准曲线及检测结果  65-66
    3.3.2 荧光标准曲线  66-67
    3.3.3 最适酶量的确定  67-69
    3.3.4 最适反应条件  69-70
    3.3.5 Km 值和 Vmax  70-72
    3.3.6 酶抑制动力学分析  72-74
4 讨论  74-79
  4.1 最适 PCR 反应条件的确定  74
  4.2 生物信息学序列分析  74-75
  4.3 构建原核表达系统  75-76
  4.4 双酶切反应的摸索  76
  4.5 不同诱导条件对 EtSir2 表达量的影响  76-77
  4.6 蛋白纯化  77
  4.7 最适酶量的确定  77-78
  4.8 最适反应条件  78
  4.9 展望  78-79
5 结论  79-80
  5.1 EtSir2 基因序列信息  79
  5.2 EtSir2 蛋白表达与纯化  79
  5.3 酶动力学分析  79
  5.4 酶抑制动力学分析  79-80
参考文献  80-83
致谢  83-84
附图  84

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜寄生虫学 > 兽医原虫学
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