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柑橘低温诱导基因Ptcor8启动子的克隆及功能验证

作　者: 宋锦羽
导　师: 龙桂友
学　校: 湖南农业大学
专　业: 果树学
关键词: 柑橘 低温诱导启动子 基因克隆 载体构建 遗传转化
分类号: S666
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


柑橘中有抗寒性强的资源,对这类资源如何通过低温锻炼获得抗寒性缺乏较深入的研究,影响了对他们的评价和利用。课题组前期研究发现,从枳中克隆得到的低温锻炼相关基因Ptcor8在柑橘不同种类中存在高度同源的同源基因,受低温诱导表达,但在不同柑橘种类上表达量差异很大,枳中的表达量是柠檬的25倍,我们推测导致不同柑橘种类同源基因表达量差异很大的原因是启动子的结构差异。因此,本试验旨在克隆Ptcor8同源基因启动子,分析同源基因启动子的结构,构建植物表达载体并转化拟南芥研究启动子是否受低温诱导。本研究取得了以下主要结果：1、克隆获得了枳Ptcor8基因启动子PPtcor8-1和PPtcor8-2序列,分别为1883bp和1865bp；以及柠檬Ptcor8同源基因启动子PClcor8序列,为1945bp。利用DNAMAN软件对获得的启动子序列进行同源性比对,发现枳的两个启动子序列PPtcor81与PPtcor82同源性为96.23%；柠檬启动子与枳启动子的碱基序列存在较大的差异,同源性分别为88.17%和86.92%。2、利用PlantCARE和PLACE分析预测枳、克里曼丁、甜橙和柠檬Ptcor8同源片段上游启动子调控元件。结果发现序列中含有大量的启动子核心元件CAAT-box和TATA-box,除此之外,还有许多逆境相关作用元件。MBS、ABRE、 LTRE和GARE-motif逆境相关作用元件是四者都含有的元件,只在数量上存在较小的差异。MBSⅡ、TC-rich repeats和CCAAT-box逆境相关作用元件是枳所特有的元件。四种来自不同柑橘种类的同源基因启动子区域都含有低温响应顺式作用元件,预示着Ptcor8基因与低温诱导有密切关系。3、以枳和柠檬叶片总DNA为模板进行PCR扩增,通过A-T克隆获得了序列两端含BamH1酶切位点的启动子目的片段,BamH1单酶切最终获得了4个含YFP荧光报告基因的植物表达载体：P1D4-PPtcor8, P1D4-PClco8、P2A1-Ptcor8和P1D4-PPtcor8-Ptcor8。4、将构建好的4个载体和原始表达载体P2A1采用花序侵染法转化拟南芥,抗性培养基筛选出了3个转化子,分别为转P1D4-PPtcor8、P1D4-PClcor8和P1D4—PPtcor8—Ptcor8拟南芥：PCR鉴定出了转P1D4—PPtcor8拟南芥。4℃低温处理转P1D4—PPtcor8拟南芥3h,报告基因表达荧光,没有低温处理(24℃)的转基因拟南芥不表达荧光,对照野生型拟南芥在常温与低温处理下均未能检测到荧光。结果表明枳启动子PPtcor8是冷诱导启动子。5、将构建好的载体转化柠檬,筛选出转化子P1D4—PPtcor8—Ptcor8.4℃低温处理转基因柠檬,报告基因表达荧光,没有低温处理(27℃)的转基因柠檬不表达荧光,结果进一步表明枳PPtcor8是低温诱导启动子。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章 前言  11-20
  1 植物基因启动子的结构及其功能  11-17
    1.1 启动子核心结构及其功能  11-12
    1.2 植物基因启动子分类  12-15
    1.3 启动子序列克隆的方法  15-17
  2 植物表达载体的构建  17
  3 植物转基因技术  17
  4 研究目的及意义  17-19
  5 技术路线  19-20
第二章 Ptcor8基因启动子克隆与分析  20-46
  1 材料与方法  20-27
    1.1 试验材料  20-23
    1.2 试验方法  23-27
  2 结果与分析  27-43
    2.1 引物设计  27-29
    2.2 植物总DNA提取与质量检测  29
    2.3 PCR结果  29-30
    2.4 PCR产物回收结果  30
    2.5 启动子A-T克隆  30-31
    2.6 启动子序列分析  31-36
    2.7 启动子元件预测  36-43
  3 讨论  43-44
  4 小结  44-46
第三章 表达载体的构建  46-67
  1 材料与方法  46-54
    1.1 试验材料  46-48
    1.2 试验方法  48-54
  2 结果分析  54-65
    2.1 启动子序列酶切位点分析  54
    2.2 目的片段克隆  54-57
    2.3 表达载体构建  57-65
  3 讨论  65-66
    3.1 黄色荧光蛋白YFP  65
    3.2 融合基因的构建  65-66
  4 小结  66-67
第四章 低温诱导启动子的功能验证  67-78
  1 材料与方法  67-72
    1.1 试验材料  67-68
    1.2 试验方法  68-72
  2 结果与分析  72-76
    2.1 重组质粒转化农杆菌  72-73
    2.2 拟南芥转化子筛选  73-74
    2.3 PCR鉴定  74-75
    2.4 低温处理转基因拟南芥及荧光检测  75
    2.5 低温处理转基因柠檬及荧光检测  75-76
  3 讨论  76-77
  4 小结  77-78
结论  78-79
创新点及展望  79-80
参考文献  80-86
附录：A  86-87
附录：B  87-112
致谢  112-113
个人简历  113

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 柑桔类
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