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转hrfl基因小麦赤霉病抗性分析与水稻RNA沉默通用载体构建

作　者: 李林
导　师: 邵敏
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 转hrf1基因小麦 赤霉病抗性 RNA沉默 载体构建 WRKY30
分类号: S512
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 9次
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内容摘要


小麦赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)引起的一种世界性的麦类真菌病害。该病害主要危害小麦的穗部,不但引起产量下降,还能够产生多种毒素,使人畜中毒,严重影响小麦的品质及商品价值。近年来随着植物遗传转化技术的不断发展,花粉管通道法、农杆菌介导法、基因枪法等用于双子叶植物转化的方法几乎都可以成功地用于小麦基因转化,这使得利用基因工程技术改良小麦品种成为可能。hrp基因簇中特定基因的编码产物harpins是具独特性质的蛋白质激发子。外源施用harpins,能激发植物产生抗病、抗虫和促生长等多种有益表型。本研究首次结合农杆菌介导和花粉管通道两种方法,在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105介导下,采用剪去颖壳滴加菌液和直接注射小穗两种侵染方法,首次将harpins编码基因hrfl转入江苏省重要小麦品种扬麦158中。经硫酸卡那霉素抗性筛选和PCR检测,获得转基因阳性株系599个,两种侵染方法的转化率分别为0.8%和1.5%,本方法不需要诱导愈伤组织,相对于传统的花粉管通道法也不需要侵染时去雄,操作简便易行。经抗性分析表明,T1代对小麦赤霉病防效为28.3%,其中高抗株系78个；这78个株系的T2代对赤霉病防效为59.7%,高抗株系34个。结果表明,转hrfl基因小麦株系对小麦赤霉病有较好的抗病性。RNA沉默是广泛存在于生物中的一种古老的基因调控机制,由于能高效、特异的调节基因表达的的特性,RNA沉默已成为基因功能研究的有力工具。在植物中普遍采取的方法是通过转基因转入一段含有内含子的反向重复序列,通过转基因的方式转入植物体内并转录,形成发夹结构,产生双链RNA,从而引起基因的沉默。本研究在双元表达载体pCAMBIA1301的基础上,选用水稻中高效的组成型启动子Ubi,水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSP synthase)第一内含子和nos终止子构建成通用的RNA沉默载体pCAMBIA1301::Ubi::Intron::Nos,并引入酶切位点XhoⅠ,AatⅡ,Spel以扩大其应用范围。本载体的使用中,只需要在Ubi, Intron之间连接上反向重复序列的正向片段,和在Intron, Nos之间连接上反向片段就构建成一个沉默载体,并且,只要在启动子和终止子之间切下内含子,换上相应基因的全序列就也可以转基因载体或超标达载体使用,操作简单易行。同时还构建了WRKY30基因的沉默载体pCAMBIA1301:: Ubi::WRKY30A::Intron::WRKY30B::Nos、超标达载体pCAMBIA1301::WRKY30::Nos和定位载体pCAMBIA1301::WRKY30::eGFP::Nos.由于RNA沉默的传递性,在构建沉默载体时避开保守区域作,选择了WRKY30基因的5’-UTR区的一段386bp的序列作为靶标来构建发夹结构,从而期望得到较好的沉默效果。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10文献综述  10-27  第一章 转基因小麦赤霉病抗性研究  11-19    1 小麦赤霉病研究进展  11-14      1.1 赤霉病菌的致病机理  11-13      1.2 赤霉病的抗性机制  13      1.3 小麦赤霉病抗性遗传  13-14      1.4 小麦抗赤霉病转基因研究  14    2 hrp基因及其编码的Harpin蛋白的特性  14-16      2.1 植物病原细菌的hrp基因  15      2.2 Harpins诱导植物抗病性  15-16    3 植物遗传转化方法  16-19      3.1 农杆菌介导  16-17      3.2 花粉管通道法  17-18      3.3 基因枪法  18-19  第二章 RNAi及其在植物基因功能研究中的应用  19-27    1 RNAi现象的发现  19-20    2 RNAi的分子机制  20-23    3 RNAi的传递性  23-24    4 RNAi在植物功能基因研究中的应用  24-27研究内容  27-73  第一章 小麦遗传转化及赤霉病抗性分析  29-41    1 材料和方法  30-35      1.1 菌株、质粒和植物材料  30-31      1.2 质粒提取  31      1.3 质粒转化农杆菌  31-32      1.4 供体菌株培养  32      1.5 遗传转化  32      1.6 转基因小麦的筛选  32-33      1.7 小麦基因组gDNA的提取  33      1.8 PCR分析  33-34      1.9 赤霉病原菌培养  34      1.10 田间接种  34-35      1.11 病害调查  35    2 结果分析  35-39      2.1 筛选浓度的确定  35-36      2.2 PCR检测  36-37      2.3 两种转化操作结果比较  37-38      2.4 T1代田间赤霉病害调查  38-39      2.5 T2代田间赤霉病害调查  39    3 讨论  39-41  第二章 RNA沉默通用载体构建  41-56    1 材料和方法  42-48      1.1 菌株和质粒  42      1.2 主要试剂  42-43      1.3 目的片段克隆  43-46      1.4 载体构建  46-48    2 结果分析  48-54      2.1 目的片段的克隆  48-51      2.2 片段连接  51-54    3 讨论  54-56  第三章 WRKY30基因功能分析载体构建及水稻转化  56-73    1 材料和方法  57-62      1.1 菌株和质粒  57      1.2 试剂、培养基、抗生素和生长素  57-58      1.3 载体构建  58-60      1.4 水稻愈伤组织诱导与继代  60      1.5 供体菌株培养  60      1.6 侵染转化与抗性筛选  60-61      1.7 分化  61-62    2 结果分析  62-71      2.1 载体构建  62-69      2.2 愈伤组织的诱导  69-70      2.3 抗性愈伤的获得  70      2.4 转基因植株的再生  70-71    3 讨论  71-73      3.1 沉默靶片段选择  71      3.2 影响土壤农杆菌转化水稻的因素  71-73参考文献  73-81附录 实验中所用缓冲液及培养基配制方法  81-85致谢  85

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦
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