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‘天源红’猕猴桃授粉受精生理特性及其相关差异蛋白质组学研究

作　者: 齐秀娟
导　师: 张绍铃
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 天源红软枣猕猴桃授粉受精花粉管胚胎发育蛋白质组
分类号: S663.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究主要以全红型软枣猕猴桃品种‘天源红’为试材,通过田间调查、石蜡切片等技术来探讨影响‘天源红’落果率相对较高的原因。同时,采用焦锑酸盐沉淀法研究了猕猴桃有性生殖过程中的花粉管生长机理。应用荧光显微镜、石蜡切片技术、差异凝胶电泳(DIGE)、质谱(MALDI-TOF/TOF)和生物信息学技术,对其授粉、受精前后花柱和子房蛋白质组进行比较研究,以期寻找授粉、受精时花柱及子房中特异表达的蛋白质,进一步研究了猕猴桃有性生殖过程中授粉受精的分子机理。主要结果如下：1.对全红型软枣猕猴桃‘天源红’花器结构、雌花开放动态及寿命、花期温度、柱头可授性、有效授粉期、授粉受精、胚胎发育、果实生长速率、落果率等进行了系统研究。(1)柱头属于干性柱头,具有一道浅裂沟,乳突呈长圆柱形；开花过程可分为以下五个阶段：花萼开裂期、花萼大裂期、花瓣变色期、大蕾期、开花期；整个开花过程温度平稳,开花整齐,雌花单花期为1-2d；柱头可授性在花后1-2d最强,花开后3-5d可授性逐渐降低,花后第6d丧失可授性；有效授粉期为开花第1d和第2d。(2)受精作用属于有丝分裂前配子融合类型。一个精子与卵细胞融合形成合子；另一个精子与次生极核融合形成初生胚乳核。(3)胚发育属茄型。卵细胞受精后,合子经过3d左右的休眠期进行第一次分裂。合子分裂通常发生在初生胚乳核分裂之后,经棒形胚、球形胚、鱼雷形胚和心形胚,至果实成熟时发育为子叶形胚。小球胚时期胚柄最为发达,球形胚末期胚柄开始退化,心形胚时期胚柄解体。(4)胚乳发育类型为细胞型。初生胚乳核先于合子分裂,胚乳细胞分裂较快,胚周围的胚乳细胞有降解现象。至胚成熟形成种子时,胚乳细胞始终分布在种皮内侧周围,因此‘天源红’属于有胚乳种子。(5)花期、有效授粉期以及柱头可授性时间短,同一子房受精不同步,胚囊、胚胎发育异常,这是‘天源红’落果率相对较高的主要原因。2.应用扫描电镜和荧光显微镜对‘天源红’同种花粉在柱头上原位萌发及花粉管生长情况进行了观察,并用焦锑酸盐沉淀法对其授粉前后柱头及花柱中Ca2+进行超微细胞化学定位,研究结果表明：(1)授粉后1h,花粉管生长穿过柱头表面,授粉后10h,生长到达花柱底部。(2)授粉前后,柱头接受面靠近柱头外围细胞的角质层一侧细胞器内含有丰富的钙,而柱头非接受表面钙颗粒分布很少。(3)授粉前和授粉后1h,花柱顶端钙颗粒较少,基部钙颗粒较多；授粉后10h,花柱顶端和基部钙分布密度无明显差别。(4)授粉前后花柱顶端钙主要均匀分布在细胞质膜位置；在花柱基部授粉前主要在引导组织胞间隙中,授粉后1h主要在细胞质内,授粉后10h主要存在于细胞质、内质网上。猕猴桃授粉前后,柱头和花柱组织中均含有钙,授粉前和授粉后1h花柱中的钙呈现出梯度分布,授粉后10h钙的梯度分布现象减弱甚至消失。3.应用荧光显微镜、石蜡切片技术、差异凝胶电泳(DIGE)、质谱(MALDI-TOF/TOF)和生物信息学技术,对其授粉、受精前后花柱和子房蛋白质组进行比较研究。(1)采用DIGE进行分离后,成功获得了蛋白质组分辨率高、蛋白点数多、分布均匀且清晰的花柱、子房双向凝胶电泳图谱。(2) DeCyder V6.5软件分析获得授粉前后花柱差异2.5倍以上的蛋白质点共有24个,质谱鉴定成功了18个点,其中有8个差异蛋白点属于actinidin家族的蛋白,另有两个差异点属于同一种蛋白质,这些蛋白质主要与水解、细胞壁代谢、逆境胁迫响应、糖类和能量代谢等有关；10个具有统计学意义的表达差异蛋白点,其中5个在花柱中表达上调,5个表达下调。根据猕猴桃授粉前后花柱差异蛋白表达谱比较,筛选出与授粉相关的花柱蛋白。(3)用DIGE进行分离并用DeCyder V6.5软件分析,在授粉前、授粉后120h的子房中共检测到约1500个蛋白质点,其中有55个差异表达的蛋白点；质谱鉴定了差异2.0倍以上的蛋白质点13个,得到了8个鉴定结果,分别属于6种蛋白质；6种差异蛋白质点,其中5种在授粉后子房中表达上调,只有1种表达下调。根据猕猴桃受精前后子房差异蛋白表达谱比较,筛选出与双受精相关的子房蛋白。

全文目录

目录  4-9
摘要  9-11
ABSTRACT  11-14
缩略语  14-15
第一章文献综述  15-33
  第一节猕猴桃生殖生物学研究进展  15-21
    1 猕猴桃属植物成花机理  15-18
      1.1 猕猴桃花芽分化过程  15-16
      1.2 猕猴桃属植物性别表现类型  16
      1.3 猕猴桃不同性别分化的细胞形态学过程  16-17
      1.4 猕猴桃属植物不同性别产生的机理  17-18
    2 花粉管在柱头上萌发、受精及胚胎发育过程  18-21
      2.1 花粉和雌蕊的相互作用  18-19
      2.2 受精过程  19-20
      2.3 胚的发育  20-21
  第二节蛋白质组学技术在果树生殖生物学方面的应用研究进展  21-29
    1 蛋白质组学概念的提出及蛋白质组学的主要研究技术  21-23
      1.1 蛋白质组学概念的提出  21
      1.2 蛋白质组学的主要研究技术  21-23
    2 蛋白质组学在果树生殖生物学中的应用  23-27
      2.1 花发育  23-24
      2.2 果实发育  24-26
      2.3 胚胎发育  26
      2.4 体胚发育  26-27
    3 讨论和展望  27-29
  第三节本研究拟解决的科学问题及意义  29-31
  第四节研究的技术路线  31-33
第二章花器结构和开花授粉生物学特性  33-41
  1 材料和方法  33-35
    1.1 材料  33-34
    1.2 方法  34-35
      1.2.1 雌花综合特征观察  34
      1.2.2 雌花开花动态及寿命  34
      1.2.3 田间温度记录  34
      1.2.4 有效授粉期  34-35
      1.2.5 柱头可授性  35
  2 结果与分析  35-39
    2.1 ‘天源红’的花部特征  35-36
    2.2 猕猴桃雌花开花动态及寿命  36-37
    2.3 花期温度变化  37
    2.4 有效授粉期  37-39
  3 讨论  39-41
第三章受精与胚胎发育特性  41-61
  1 材料和方法  41-43
    1.1 材料  41
    1.2 试验方法  41-43
      1.2.1 果实生长动态及落果率调查  41-42
      1.2.2 花粉管行为的荧光观察  42
      1.2.3 扫描电镜的观察  42
      1.2.4 受精及胚胎发育的观察  42-43
  2 结果与分析  43-57
    2.1 受精作用  43-44
      2.1.1 花粉在柱头上萌发和花粉管的生长  43-44
      2.1.2 花粉管进入胚囊,释放其内容物  44
    2.2 一个精子与卵细胞融合,形成合子  44-48
    2.3 另一个精子与中央细胞的次生核融合,发育成胚乳  48-49
    2.4 受精过程的间隔期  49-50
    2.5 胚乳的发育  50
    2.6 胚的发育  50-54
    2.7 胚胎发育的异常现象  54-55
    2.8 ‘天源红’外部形态与受精及胚、胚乳发育阶段的对应关系  55-57
  3 讨论  57-61
    3.1 花粉管在柱头上的原位萌发、生长的速度  57-58
    3.2 受精前关于两个极核、助细胞和反足细胞的行为  58
    3.3 双受精时间  58-59
    3.4 胚胎发育  59-61
第四章花粉管原位生长过程中Ca~(2+)的超微细胞化学定位  61-69
  1 材料  62
  2 Ca~(2+)超微细胞化学定位方法  62
  3 结果与分析  62-64
    3.1 授粉前后柱头Ca~(2+)的分布变化  62-63
    3.2 授粉前后花柱的Ca~(2+)分布变化  63-64
  4 讨论  64-69
    4.1 柱头表面内Ca~(2+)的分布及其作用  64
    4.2 花柱内是否存在Ca~(2+)分布梯度  64-69
第五章传粉前后柱头/花柱蛋白质组DIGE分析  69-99
  1 植物材料与方法  70-77
    1.1 植物材料  70
    1.2 主要生化试剂与仪器设备  70-71
      1.2.1 主要生化试剂  70
      1.2.2 主要仪器设备  70-71
      1.2.3 相关溶液的配方  71
    1.3 试验方法  71-76
      1.3.1 花柱材料的处理方法  71-72
      1.3.2 花柱内花粉管生长情况的观察  72
      1.3.3 花柱样品蛋白质提取  72
      1.3.4 蛋白质定量  72
      1.3.5 向电泳预实验  72-73
      1.3.6 快速银染法  73
      1.3.7 荧光染料标记  73-74
      1.3.8 DIGE电泳  74
      1.3.9 图像分析  74-75
      1.3.10 胶内酶解及肽段提取  75
      1.3.11 MALDI-TOF/TOF MS分析  75-76
      1.3.12 蛋白质数据库检索  76
    1.4 技术路线图  76-77
  2 结果与分析  77-95
    2.1 授粉前后花柱荧光特性的差异  77
    2.2 花柱蛋白质的提取及IPG-DALTA向预电泳  77-78
    2.3 蛋白质定量  78-79
    2.4 授粉前和授粉后10h花柱蛋白质组DIGE分析  79-83
    2.5 授粉前后花柱内差异表达蛋白质的鉴定与分析  83-89
    2.6 鉴定蛋白质的氨基酸全序列  89-91
    2.7 差异表达蛋白功能鉴定  91-95
  3 讨论  95-99
    3.1 水解蛋白  95-96
    3.2 胁迫和防御反应蛋白  96-97
    3.3 能量和糖代谢有关的蛋白  97
    3.4 调控相关蛋白  97
    3.5 功能未知蛋白  97-99
第六章受精前后子房蛋白质组DIGE分析  99-123
  1 植物材料与方法  99-101
    1.1 植物材料  99-100
    1.2 主要生化试剂与仪器设备  100
    1.3 试验方法  100-101
      1.3.1 子房材料的处理方法  100
      1.3.2 子房受精情况观察  100
      1.3.3 子房样品蛋白质提取  100
      1.3.4 双向电泳预实验  100
      1.3.5 荧光染料标记  100
      1.3.6 DIGE电泳  100-101
      1.3.7 图像分析  101
      1.3.8 胶内酶解及肽段提取  101
      1.3.9 MALDI-TOF/TOF MS分析  101
      1.3.10 蛋白质数据库检索  101
  2 结果与分析  101-120
    2.1 授粉受精前后子房状态  101-102
    2.2 子房蛋白质定量、IPG-DALTA双向预电泳及SDS-PAGE荧光染料预标记试验  102-103
    2.3 称猴桃授粉前和授粉后120 h子房蛋白质组DIGE分析  103-109
    2.4 授粉前和授粉后120h子房蛋白质组快速银染2D图  109
    2.5 授粉前后子房内差异表达蛋白质的鉴定与分析  109-114
    2.6 差异蛋白质的功能鉴定  114-117
    2.7 鉴定蛋白质的氨基酸全序列  117-120
  3 讨论  120-123
综合讨论  123-127
全文结论  127-129
创新点  129-131
参考文献  131-149
致谢  149-151
在读期间发表的学术论文  151-153
在读期间主持的科研项目  153

‘天源红’猕猴桃授粉受精生理特性及其相关差异蛋白质组学研究

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