学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

PRSV编码基因同源dsRNA的原核表达及其抗番木瓜环斑病毒的研究

作　者: 杨国峰
导　师: 周鹏
学　校: 海南大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 番木瓜木瓜环斑病毒 dsRNA 原核表达 RNA沉默介导的抗性
分类号: S436.67
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 45次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

番木瓜环斑病毒(Papaya Ringspot Virus, PRSV)是属于马铃薯Y病毒(genus Potyvirus, family Potyviridae)的一种植物病毒,为单链正义RNA, PRSV引起的番木瓜环斑病病毒病在全球各生长区给番木瓜种植业造成了严重的损失,病毒编码的复制酶(NIb)、辅助蛋白(HC-Pro)和外壳蛋白(CP)等参与蚜虫介导的传毒、病毒在宿主细胞内复制、积累及细胞间运动等过程,在病毒为害番木瓜的过程中发挥着重要作用。人们在生产实践中积累的控制PRSV的常规方法大多是限制蚜虫介导的传播或销毁病株,仅能在一定程度上控制病毒的蔓延,并不能直接消除病毒,非常被动。番木瓜杂交抗病毒育种因其种内缺乏抗病资源、种间杂交不亲和等原因,一直进展缓慢,尚未得到适合大面积推广应用的高抗品系。基因工程技术克服了番木瓜抗病毒种质资源缺乏的困难,充分利用了来自病毒和其他种属植物的抗病毒基因,为番木瓜抗病毒育种开辟了新的有效途径。但转基因抗病毒番木瓜的抗性谱较窄,能高抗PRSV某一株系的转基因番木瓜品系往往对其它地区的其他PRSV株系无效或只有低度抗病性,且转基因番木瓜植株潜在的生态风险和食品安全问题也饱受争议,限制了基因工程技术的应用。番木瓜生产中迫切需要既适合于大田生产、又行之有效的PRSV防治方法。本研究利用dsRNA介导的RNA沉默抗病毒机制,构建了PRSV编码基因同源dsRNA的原核表达系统,并使用诱导表达的同源dsRNA处理番木瓜植株,研究了利用原核表达的dsRNA防治番木瓜环斑病毒病的可行性。通过对已报道PRSV株系的NIb基因、HC-Pro基因和CP基因的序列同源性比对,发现这3个编码基因的3’端序列的同源性均较高。本研究通过PCR扩增得到了PRSV HN株系NIb基因、HC-Pro基因和CP基因3’端的N312、N501、N809、H315、H489、 H824、C279、C432、C867等9个核苷酸序列,利用OZ-LIC法分别构建了与N312、N501、 N809、H315、H489、H824、C279、C432、C867同源的发夹RNA编码结构(含有PDK内含子),以M-JM1091acY菌株为宿主菌分别构建了高效的PRSV编码基因同源dsRNA原核表达系统M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-N312、M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-N501、 M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-N809、M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-H315、 M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-H489、M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-H824、 M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-C279、M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-C432、 M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-C867。经IPTG诱导成功利用原核系统表达了dsRNA,并证明dsRNA不被DNase I和RNase A降解,稳定性较好。本研究分别用PRSV Nib基因、HC-Pro基因、CP基因构建了GFP瞬时植物融合表达载体pNIb-GFP、pHC-GFP、pCP-GFP。对经Trizol法提取的dsRNA和对应GFP瞬时融合表达载体共转化的番木瓜叶片原生质体的共聚焦显微镜观察及通过半定量RT-PCR对其中mRNA表达量的分析结果证实：融合基因NIb-GFP、HC-GFP、CP-GFP的表达均发生了不同程度的下调,说明dsRNA在原生质体中引发了针对同源基因的沉默。本研究采用高压细胞破碎法处理经IPTG诱导的dsRNA原核表达工程菌细胞制备不同的dsRNA粗制品,利用dsRNA粗制品分别在接种PRSV前对番木瓜植株进行保护性处理、在表现环斑病症状后对番木瓜植株进行治疗性处理,并实施了田间的保护性处理实验。保护性处理实验结果显示,N312-dsRNA、N501-dsRNA、N809-dsRNA、 H315-dsRNA、H489-dsRNA、H824-dsRNA、C279-dsRNA、C432-dsRNA、C867-dsRNA实验组分别表现出了27%、50%、60%、20%、44%、50%、27%、40%、54%的抗病性,ELISA分析和Real-time PCR结果证实实验组番木瓜叶片中的病毒积累受到了不同程度的抑制,Northern杂交实验结果说明其抗性是由RNA沉默引起的抗性。治疗性处理实验结果显示,N312-dsRNA、N501-dsRNA、N809-dsRN、H315-dsRNA、H489-dsRNA、 H824-dsRNA、C279-dsRNA、C432-dsRNA、C867-dsRNA实验组在喷洒后dsRNA后第3天均检测到病毒积累量的小幅下降,第10天左右有部分染病植株叶片出现回绿或新长出的叶片没有症状,但随后病毒积累量又恢复至对照水平,回绿叶片重新花叶,无症状叶片也表现出症状,Northern杂交结果表明病毒积累量的下降是RNA沉默所致。田间保护性实验结果显示,定期喷洒N809-dsRNA粗制品使番木瓜植株获得了稳定抵抗PRSV的能力,在近距离生长的对照植株发病的情况下处理植株仍能保持不发病,长期保持较好长势,效果良好,证明该方法是一种绿色、廉价、便捷、有效的番木瓜环斑病毒防治方法。以上这些研究结果为利用dsRNA引发RNA沉默防治番木瓜环斑病毒的田间应用奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
1 前言  12-30
  1.1 番木瓜环斑病和番木瓜环斑病毒(PRSV)  12-17
    1.1.1 概述  12-13
    1.1.2 PRSV基因组学  13-17
      1.1.2.1 PRSV基因组结构  13-14
      1.1.2.2 PRSV编码蛋白的功能  14-16
      1.1.2.3 序列多样性及进化  16-17
  1.2 番木瓜环斑病的防治  17-26
    1.2.1 常规方法  17-20
    1.2.2 基因工程  20-26
      1.2.2.1 RNA沉默介导的植物抗病毒机制  20-23
      1.2.2.2 基因工程在抗番木瓜环斑病毒研究中的应用  23-25
      1.2.2.3 抗病毒转基因植物的安全风险分析  25-26
  1.3 利用原核表达的dsRNA抗植物病毒研究进展  26-28
  1.4 本研究的目的与意义  28-30
2 实验材料、试剂及仪器等  30-35
  2.1 植物和病毒材料  30
  2.2 大肠杆菌菌株  30
  2.3 质粒载体  30-32
  2.4 引物  32-34
  2.5 仪器  34-35
3 实验方法  35-60
  3.1 原核表达PRSV编码基因同源dsRNA的研究  35-44
    3.1.1 PRSV不同编码基因序列的克隆  35-36
    3.1.2 PRSV编码基因同源dsRNA原核表达载体的构建  36-41
      3.1.2.1 含内含子的发夹RNA编码结构的构建  36-40
      3.1.2.2 原核表达载体的构建  40-41
    3.1.3 PRSV编码基因同源dsRNA原核表达工程菌株的构建  41-42
    3.1.4 PRSV编码基因同源dsRNA的诱导表达  42-44
  3.2 利用番木瓜叶片原生质体瞬时表达体系检测dsRNA的沉默效果  44-50
    3.2.1 PRSV编码基因-GFP瞬时植物融合表达载体的构建  44-46
    3.2.2 番木瓜叶片原生质体的分离和转化  46-48
      3.2.2.1 试剂的配制  46-47
      3.2.2.2 原生质体的分离  47
      3.2.2.3 瞬时融合植物表达载体与dsRNA共转化番木瓜叶片原生质体  47-48
    3.2.3 PRSV不同编码基因序列-GFP融合mRNA表达量的半定量RT-PCR检测  48-50
      3.2.3.1 番木瓜叶片原生质体细胞总RNA的提取  49
      3.2.3.2 RT-PCR检测mRNA表达量  49-50
  3.3 原核表达的PRSV编码基因同源dsRNA抗番木瓜环斑病毒的研究  50-59
    3.3.1 dsRNA粗制品制备方法的筛选  50-52
      3.3.1.1 高压细胞破碎法  50
      3.3.1.2 溶菌酶法  50-51
      3.3.1.3 冻融法  51
      3.3.1.4 粗制品中dsRNA的提取  51-52
    3.3.2 粗制品中dsRNA的稳定性检测  52
    3.3.3 接种PRSV至番木瓜植株  52
    3.3.4 使用dsRNA粗制品处理番木瓜植株  52-54
      3.3.4.1 保护性处理  53
      3.3.4.2 治疗性处理  53-54
    3.3.5 ELISA分析  54-55
    3.3.6 实时定量分析  55-57
      3.3.6.1 番木瓜叶片总RNA的提取  56
      3.3.6.2 反转录  56
      3.3.6.3 Real Time PCR  56-57
    3.3.7 siRNA Northern杂交  57-59
      3.3.7.1 RNA探针的制备  57
      3.3.7.2 siRNA提取  57-58
      3.3.7.3 PAGE电泳  58
      3.3.7.4 转膜  58-59
      3.3.7.5 siRNA杂交和放射自显影  59
  3.4 使用N809-dsRNA粗制品抗番木瓜环斑病的田间试验  59-60
4 结果  60-81
  4.1 含PRSV不同编码基因序列dsRNA的原核表达  60-64
    4.1.1 PRSV不同编码基因序列的克隆  60
    4.1.2 含PRSV不同编码蛋白基因序列dsRNA原核表达载体的构建  60-63
      4.1.2.1 含内含子的发夹RNA编码结构的构建  60-62
      4.1.2.2 原核表达载体的构建  62-63
    4.1.3 含PRSV不同编码基因序列的dsRNA原核表达工程菌株的构建  63
    4.1.4 含PRSV不同编码基因序列dsRNA的诱导表达  63-64
  4.2 利用番木瓜叶片原生质体瞬时表达体系检测dsRNA的沉默效果  64-69
    4.2.1 PRSV不同编码基因序列-GFP瞬时植物融合表达载体的构建  64-66
    4.2.2 番木瓜叶片原生质体的分离和转化  66-68
      4.2.2.1 番木瓜叶片原生质体的分离  66
      4.2.2.2 番木瓜叶片原生质体的转化  66-68
    4.2.3 PRSV不同编码基因-GFP融合mRNA表达量的半定量RT-PCR检测  68-69
  4.3 利用原核表达的含PRSV不同编码基因序列dsRNA防治番木瓜环斑病  69-79
    4.3.1 dsRNA粗制品制备方法的筛选  69
    4.3.2 粗制品中dsRNA的稳定性检测  69-70
    4.3.3 dsRNA介导的抗病性鉴定  70-79
      4.3.3.1 保护作用  70-76
        4.3.3.1.1 番木瓜植株的发病情况  70-72
          4.3.3.1.1.1 保护处理后第2天接种PRSV的番木瓜植株发病情况  70-71
          4.3.3.1.1.2 保护处理后第3天和第5天接种PRSV的番木瓜植株发病情况  71-72
        4.3.3.1.2 ELISA分析  72-74
        4.3.3.1.3 实时定量分析  74-75
        4.3.3.1.4 siRNA Northern杂交检测  75-76
      4.3.3.2 治疗作用  76-79
        4.3.3.2.1 番木瓜环斑病症状的发展情况  76
        4.3.3.2.2 ELISA分析  76-78
        4.3.3.2.3 实时定量分析  78
        4.3.3.2.4 siRNA Northern杂交检测  78-79
  4.4 N809-dsRNA粗制品抗番木瓜环斑病的田间试验  79-81
5 讨论  81-86
  5.1 dsRNA原核表达载体  81-82
  5.2 dsRNA原核表达宿主菌  82
  5.3 dsRNA的摄入途径  82-83
  5.4 dsRNA的稳定性及其制品的制备方法  83-84
  5.5 dsRNA介导的抗病性  84-86
6 结论  86-87
参考文献  87-94
致谢  94

PRSV编码基因同源dsRNA的原核表达及其抗番木瓜环斑病毒的研究

内容摘要

全文目录

相似论文