学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

potA和mreB在胡萝卜软腐果胶杆菌中的功能研究

作　者: 邓亚岷
导　师: 范加勤
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 胡萝卜软腐果胶杆菌 potA mreB 致病性致病因子
分类号: S436.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 4次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterterium carotovorum subsp. carotovorum,以下简称Pcc)是引起细菌性软腐病的重要病原菌。其寄主广泛,可侵染多种经济作物及观赏性植物,并造成严重的经济损失,而目前尚缺少有效的防控对策。因此,近年来对Pcc致病性的相关研究逐渐深入,为提出理想的防治方法提供依据。本实验室前期研究结果证实：Pcc与黄花马蹄莲(Zantedeschia elliotiana)活体互作过程中多种蛋白上调表达,其中包括亚精胺／腐胺ABC转运系统ATP激酶(spermidine/putrescine ABC transporter ATPase)和杆状决定蛋白(rod shape-determining protein),为了阐明相应编码基因potA(PC1-1693)和mreB(PC1-0252)在Pcc致病过程中的功能,本研究对PccSl中多个相关基因进行缺失突变,并比较了突变株和野生菌株间致病性与相关生物学的表型差异,分析了相关基因在Pcc致病过程中的功能,为阐述Pcc的致病机理提供依据。利用同源重组的方法对亚精胺／腐胺ABC转运系统的4个亚基编码基因potA、 potB.potC.potD及potCD进行缺失突变。不同突变株致病性测定结果表明：与PccS1相比,只有ApotA的致病性显著下降,而△potB、△potC、△potD和△potCD的致病能力均无明显变化。RT-PCR结果显示,各突变株中亚精胺合成的关键基因speE的转录水平均上调。ApotA致病相关表型测定结果显示：与PccS1相比,ApotA的沉降速率减缓,蛋白酶的活性降低,游动能力、产生碳青霉烯抗生素的能力、生物膜形成能力和抗氧化能力均下降。且potA的缺失不影响PccS1的生长速率、纤维素酶和果胶酶活性及对非寄主的过敏反应。为了进一步探索导致ApotA致病性下降的分子机制,对ApotA和PccS1进行了转录组测序分析与比较。试验表明：与PccS1相比,ApotA中共有396个基因发生了差异表达,其中上调表达的基因为86个,下调表达的基因为246个。经分析发现,差异表达基因中上调表达的基因主要涉及硝酸盐还原和物质运输等方面,而下调表达基因主要与趋化性、分泌系统和转录调节等相关基因有关。并用RT-PCR分析验证了相关致病因子的转录水平。此外,本研究利用相同的方法对杆状决定蛋白的编码基因mreB进行了研究,结果显示：与PccS1相比,(1)△mreB的致病性明显降低；(2)突变株的菌体形态发生变化,由原先的杆状变为球形；(3)生长能力有所下降,且在基础培养基上不能正常生长；(4)游动性丧失；(5)产生胞外果胶酶的能力丧失,蛋白酶的产量显著下降；(6)产生碳青霉烯抗生素能力下降；(7)生物膜形成能力有所降低。但产生纤维素酶的能力和对非寄主的过敏反应无显著差异。综上所述,在Pcc致病过程中,potA和mreB均通过影响多个致病相关因子从而降低细菌的致病能力,其调控途径尚有待进一步研究。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
上篇文献综述  10-23
  第一章细菌性软腐病的研究进展  11-23
    1 细菌性软腐病的概述  11
    2 胡萝卜软腐果胶杆菌介绍  11-12
    3 胡萝卜软腐果胶杆菌的致病机理  12-21
      3.1 胡萝卜软腐果胶杆菌的致病因子  12-16
      3.2 致病因子的分泌  16-19
      3.3 致病因子的调控  19-20
      3.4 致病过程  20-21
    4 细菌性软腐病的防治  21-23
      4.1 农业防治  21
      4.2 化学防治  21
      4.3 生物防治  21-23
下篇研究内容  23-75
  第一章胡萝卜软腐果胶杆菌中potA基因的功能分析  25-63
    摘要  25-27
    1 试验材料  27-31
      1.1 供试菌株和质粒  27-28
      1.2 主要试剂和仪器  28-29
      1.3 培养基  29
      1.4 抗生素  29-30
      1.5 引物  30-31
    2 试验方法  31-48
      2.1 细菌基因组DNA提取  31
      2.2 质粒的提取  31-32
      2.3 细菌RNA的提取  32-33
      2.4 DNA酶切、反应产物回收和连接  33-34
      2.5 质粒DNA的转化  34-35
      2.6 Southern杂交  35-39
      2.7 突变体的构建  39-40
      2.8 互补菌株和过表达菌株的构建及验证  40
      2.9 致病性的测定  40-41
      2.10 细菌形态、生长能力、游动性、沉降性的测定  41
      2.11 致病因子的测定  41-43
      2.12 qRT-PCR检测  43-45
      2.13 转录组测序与分析  45-48
    3 结果与分析  48-59
      3.1 突变株的构建及验证  48-49
      3.2 △potA(potA)、△potA(pBBR)和PccS1(potA)的构建及验证  49-50
      3.3 potA影响PccS1的致病性  50-52
      3.4 相关生物学特性测定结果  52-53
      3.5 相关致病因子的测定结果  53-55
      3.6 qRT-PCR的测定结果  55-59
    4 讨论与结论  59-63
  第二章胡萝卜软腐果胶杆菌中mreB基因的功能分析  63-75
    摘要  63-64
    1 试验材料  64-65
      1.1 供试菌株和质粒  64
      1.2 主要试剂和仪器  64
      1.3 培养基  64-65
      1.4 抗生素  65
      1.5 引物  65
    2 试验方法  65-67
      2.1 细菌基因组DNA提取  65
      2.2 质粒的提取  65
      2.3 细菌RNA的提取  65-66
      2.4 DNA酶切、反应产物回收和连接  66
      2.5 质粒DNA的转化  66
      2.6 Southern杂交  66
      2.7 突变体的构建  66-67
      2.8 互补菌株和过表达菌株的构建及验证  67
      2.9 致病性的测定  67
      2.10 细菌形态、生长能力、游动性、沉降性的测定  67
      2.11 致病因子的测定  67
      2.12 qRT-PCR检测  67
    3 结果与分析  67-73
      3.1 突变株的构建及验证  67-68
      3.2 互补菌株和过表达菌株的构建及验证  68
      3.3 突变株的致病性和过敏性分析  68-69
      3.4 相关生物学特性测定结果  69-70
      3.5 相关致病因子的测定结果  70-72
      3.6 qRT-PCR的测定结果  72-73
    4 讨论与结论  73-75
全文总结  75-77
参考文献  77-85
致谢  85

potA和mreB在胡萝卜软腐果胶杆菌中的功能研究

内容摘要

全文目录

相似论文