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稻瘟病菌中一个假定的MgRhoGef1蛋白的功能初探

作　者: 石振华
导　师: 鲁国东
学　校: 福建农林大学
专　业: 遗传学
关键词: 稻瘟病菌 Rho GTP酶 MgRhoGef1 附着胞 致病性
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


Rho1是小G蛋白Rho族的一个重要成员,它存在两种相互转化的状态:GDP结合的失活状态和GTP结合的活性状态。GDP/GTP交换因子（GEF1）的功能是促进Rho1从GDP结合态向GTP结合态的转换。本研究首先通过生物信息学的方法对MGG12644这个基因的理论等电点、分子量、结构域以及功能等进行预测分析,结果显示该基因是小G蛋白Rho1的GEF,同时该基因的变化与物种的进化相吻合。然后以稻瘟病菌为模式生物,通过同源重组的方法得到该基因的敲除突变体,发现该基因的缺失突变体虽然生长速度缓慢,然而隔膜间距与野生型相比却无明显差异,说明该基因可能参与了细胞分裂周期的调控。突变体在加有SDS的淀粉培养基中的生长速度受到抑制,说明对SDS的耐性能力降低。此外,突变体不能产生分生孢子,菌丝末端虽然可以分化生成附着胞,但产生的附着胞的数量也很少且附着胞丧失了侵染洋葱表皮及水稻叶片的能力,因而在造伤和非造伤的叶片上都不能形成病斑。这些表型都受到Rho1的调控,因而推测该基因与Rho1的功能有关。将带有启动子的MgRhoGEF1基因转入缺失敲除突变中,突变体的表型得以恢复,说明敲除突变体表型的出现是由于MgRhoGef1的缺失直接或间接导致。利用酵母双杂交的方法证实了MgRhoGef1及其结构域都能与Rho1互作,因而对MgRhoGef1的研究有利于了解Rho1的功能,完善对Rho1的认识。又由于MgRhoGef1的缺失导致稻瘟病菌丧失致病能力,因而有可能通过该基因的研究找到合适药物靶标,为稻瘟病的防治提供新的策略。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-9
第一部分 引言  9-22
  1 小 G 蛋白的结构和功能  9-12
    1.1 小G 蛋白分类  9
    1.2 小G 蛋白的结构  9
    1.3 小G 蛋白的作用原理  9-11
    1.4 小G 蛋白的定位  11-12
  2 Rho 族蛋白调控细胞骨架的重组和基因表达  12-16
    2.1 Rho 族蛋白综述  12
    2.2 Rho 族蛋白调控细胞骨架肌动蛋白的重组  12-13
    2.3 Rho 族蛋白的活性状态与非活性状态之间的转换调控  13
    2.4 Rho 蛋白的效应因子  13-14
    2.5 Rho 蛋白在基因表达中的作用方式  14
    2.6 Rho1 蛋白在细胞骨架重组中的作用模式  14-15
    2.7 Rho 蛋白的其他功能  15-16
  3 GEF 蛋白结构功能分析  16-21
    3.1 GEF 蛋白中的结构域  16-17
    3.2 GEF 蛋白功能分析  17-18
    3.3 GEFs 的作用机制  18-19
    3.4 Rho1 与其GEF 互作的研究进展  19-21
      3.4.1 Rho1 与GEF 的互作模式  19
      3.4.2 GEF-H1 通过RhoA 诱导细胞收缩过程中微管蛋白的解离  19-20
      3.4.3 RhoA 在NET1 介导下催进细胞迁移  20-21
  4. 稻瘟病菌产孢及其侵染致病机制  21-22
    4.1 稻瘟病菌的危害  21
    4.2 稻瘟病菌简介  21-22
  5 稻瘟病菌 Rho 族蛋白的研究意义  22
第二部分 材料与方法  22-38
  1 试验材料  22-24
    1.1 供试菌株  22
    1.2 培养基  22-23
    1.3 抗生素  23
    1.4 生化试剂  23-24
  2 试验方法  24-38
    2.1 生物信息学分析  24
      2.1.1 蛋白序列极其保守结构域的同源性比较及其系统演化关系分析  24
      2.1.2 蛋白结构域的分析  24
    2.2 稻瘟病菌敲除及互补突变体的表型分析  24-26
      2.2.1 稻瘟病菌菌落生长速度测定  24
      2.2.2 菌丝、分生孢子、附着胞的形态观察以及分生孢子和附着胞的产量统计  24-25
      2.2.3 孢子萌发及附着胞形成试验  25
      2.2.4 分生孢子及菌丝对洋葱表皮的侵染观察  25
      2.2.5 大麦及水稻叶片接种试验  25-26
    2.3 分子生物学分析及检测方法  26-38
      2.3.1 稻瘟病菌基因组DNA 的提取及提取质量的检测  26
      2.3.2 快速提取稻瘟病菌基因组DNA  26-27
      2.3.3 碱裂解法提取质粒DNA  27-28
      2.3.4 稻瘟病菌菌丝体total RNA 的提取及检测  28
      2.3.5 反转录  28-29
      2.3.6 基因克隆  29-31
      2.3.7 稻瘟病菌原生质体制备和转化  31-32
      2.3.8 筛选抗性转化子  32
      2.3.9 Southern 杂交  32-35
      2.3.10 酵母双杂交  35-38
      2.3.11 MgRhoGef1 互补载体的构建  38
第三部分 结果与分析  38-55
  1 生物信息学分析  38-43
    1.1 稻瘟病菌 MgRhoGef1 蛋白的结构及功能分析  38-39
    1.2 MgRhoGef1 蛋白序列同源性搜索比对及其系统演化关系分析  39-42
    1.3 蛋白序列的等电点及分子量分析  42-43
  2 表型分析  43-53
    2.1 敲除突变体的筛选与验证  43
    2.2 敲除突变体的抗性筛选  43-45
    2.3 突变体生长速度测定  45-48
      2.3.1 突变体在淀粉酵母培养基中的生长状况  45-46
      2.3.2 突变体在加有SDS 的淀粉酵母培养基中的生长状况  46-48
    2.4 菌丝产附着胞  48-50
    2.5 突变体的产孢能力  50-51
    2.6 突变体的致病性  51-53
  3 酵母双杂交  53-54
  4 Rho 家族蛋白及 RhoGef2 在MgRhoGef1 突变体中的表达量  54-55
第四部分 小结与讨论  55-59
  1 小结  55-58
    1.1 稻瘟病菌中MgRhoGef1 蛋白的特征分析  55-56
    1.2 稻瘟病菌中该假定的MgRhoGef1 蛋白与Rho1 蛋白的关系初探  56-58
      1.2.1 生物信息学分析中二者的相关性  56
      1.2.2 MgRhoGef1 突变体表型分析中Rho1 功能的体现  56-58
  2 研究意义  58-59
参考文献  59-74
附表1  74-83
致谢  83

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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