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稻瘟病菌F-box基因缺失突变体构建及生物学表型分析

作　者: 喻海峰
导　师: 高智谋
学　校: 安徽农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌 Mofbox突变体 附着胞 致病性
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是水稻生产上最具破坏性的致病真菌之一，严重威胁着水稻的安全生产。近年来，随着稻瘟病菌全基因组数据的公布，加速了人们对其致病相关基因的挖掘进程；同时也使得它与水稻的互作研究成为探索寄主与植物病原真菌互作机制的理想模式之一。从分子水平解析稻瘟病菌的生长发育过程及致病分子机制，对有效控制病害发生及促进水稻安全生产和提高品质具有重要的科学意义。本文采用啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）F-box蛋白的氨基酸序列，对稻瘟病菌全基因组数据库进行Blastp分析，获得一个与之同源的蛋白编码基因MGG06351.6，命名为Mofbox。序列分析发现，该基因编码的蛋白氨基端有一个典型的F-box结构域，羧基端存在一个核定位信号（KTKR）。采用同源重组方法，构建基因敲除载体并转化野生型菌株Guy11，获得2个基因缺失突变体。研究表明，缺失Mofbox后，可使稻瘟病菌生长速率较Guy11菌株下降10.0%左右，敲除突变体对NaCl、SDS和H2O2的耐受性分别减弱5.0%、6.0%和17.0%，但对CFW和CR的耐受性分别增加2.5%和4.1%；M ofbox突变体产分生孢子的能力较Guy11菌株分别显著下降55.0%和52.0%；Mofbox突变体对四棱大麦和水稻（敏感品种CO-39）的致病性显著降低。进一步研究发现，突变体分生孢子在疏水界面上形成附着胞的能力较Guy11菌株显著降低，且膨压下降；洋葱表皮侵染试验亦表明，野生型菌株和突变体菌株形成的附着胞均可穿透洋葱细胞壁，但与野生型菌株Guy11相比，突变体的穿透率降低38.0%；同时，突变体侵入后形成的侵染菌丝不能在洋葱表皮细胞中扩展；在突变体中，与附着胞形成相关的基因Rho3、MST11、MST50、 PMK1和MPG1转录水平较野生型菌株也显著下降。综上所述，Mofbox在稻瘟病菌菌丝生长速率、产孢能力、对外源氧化压力耐受性、细胞壁完整性、附着胞形成及致病性等方面具有重要的调控作用。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-7
1 文献综述  7-17
  1.1 稻瘟病概况  7-8
    1.1.1 稻瘟病与稻瘟病菌  7
    1.1.2 稻瘟病菌的生活史和侵染循环  7-8
  1.2 稻瘟病菌致病相关基因的研究现状  8-14
    1.2.1 参与产孢过程的相关基因  8
    1.2.2 参与附着胞发育的相关基因  8-13
    1.2.3 参与附着胞膨压形成的相关基因  13-14
  1.3 F-box 蛋白及其调节作用  14-17
    1.3.1 F-box 蛋白  14
    1.3.2 F-box 蛋白调节作用  14-17
2 引言  17-18
3 材料与方法  18-28
  3.1 供试菌株  18
  3.2 供试培养基  18-20
  3.3 供试菌株培养  20
  3.4 稻瘟病菌总 DNA、mRNA 提取及 cDNA 的制备  20-22
    3.4.1 稻瘟病菌菌丝 DNA 的提取  20
    3.4.2 RNA 的提取  20-21
    3.4.3 第一链 cDNA 的合成  21-22
  3.5 Mofbox 氨基酸序列获得及分析  22
  3.6 Mofbox 敲除载体构建及突变体鉴定  22-25
    3.6.1 Mofbox 敲除载体构建  22-23
    3.6.2 原生质体制备  23-24
    3.6.3 原生质体转化  24
    3.6.4 Mofbox 敲除突变体的筛选及验证  24-25
    3.6.5 Mofbox 突变体的基因回补  25
  3.7 Mofbox 突变体生物学表型分析  25-26
    3.7.1 Mofbox 突变体在不同培养基上的生长速率比较  25
    3.7.2 Mofbox 突变体对几种胁迫因子的敏感性分析  25
    3.7.3 Mofbox 突变体原生质体释放观察  25
    3.7.4 Mofbox 突变体产孢量测定  25-26
    3.7.5 Mofbox 突变体附着胞形成及膨压测定  26
  3.8 Mofbox 突变体致病性分析  26
    3.8.1 Mofbox 突变体对大麦致病性测定  26
    3.8.2 Mofbox 突变体对水稻致病性的测定  26
  3.9 Mofbox 突变体分生孢子的洋葱表皮侵染观察  26-27
  3.10 实时荧光定量 PCR 检测突变体中基因的表达  27-28
4 结果与分析  28-36
  4.1 MGG_06351.6 基因的生物信息学分析  28-29
  4.2 稻瘟病菌 Mofbox 敲除突变体的构建、筛选与鉴定  29
  4.3 Mofbox 参与稻瘟病菌菌丝生长  29-30
  4.4 Mofbox 缺失影响稻瘟病菌产孢能力  30-31
  4.5 Mofbox 参与稻瘟病菌的致病性  31
  4.6 Mofbox 缺失影响稻瘟病菌对外源胁迫的耐受性  31-32
  4.7 Mofbox 缺失影响稻瘟病菌细胞壁完整性  32-33
  4.8 Mofbox 缺失影响稻瘟病菌附着胞形成及膨压积累  33-34
  4.9 Mofbox 缺失影响侵染菌丝在洋葱表皮细胞内的扩展  34-35
  4.10 Mofbox 缺失影响稻瘟病菌多个附着胞形成相关的基因表达  35-36
5 小结与讨论  36-38
参考文献  38-46
致谢  46-47
作者简介  47

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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