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水稻白叶枯病菌PXO99~A中PhaR基因突变对其在水稻上的致病性和烟草过敏反应的影响

作　者: 崔晓芳
导　师: 宋从凤
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻白叶枯病菌 PhaR基因缺失突变体致病性过敏反应
分类号: S435.111.47
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

水稻白叶枯病是由稻黄单胞水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的一种重要细菌性病害。聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate, PHA)是微生物细胞内一种碳和能量的储藏物质,许多微生物在营养不均衡的条件下可以合成PHA。基因组序列分析发现水稻白叶枯病菌PXO99A中存在多个PHA合成相关基因,其中包括PHA合成调控基因PhaR。本实验室先前采用基于同源交换的基因敲除的方法构建了水稻白叶枯病菌PhaR基因的缺失突变体。本研究主要对PhaR基因缺失突变体进行功能互补,通过研究PhaR基因缺失突变体的生物学特性、对水稻的致病性和烟草的过敏反应来揭示PhaR基因在水稻白叶枯病菌致病过程中的作用。首先对PhaR基因缺失突变体进行了功能互补。将水稻白叶枯病菌PXO99A中的PhaR编码基因连入表达载体pHM1后通过冷冻转化法将其转入PhaR基因缺失突变体中,获得PhaR基因缺失突变体的功能互补子。研究其生物学特性时发现,PhaR基因突变后Xoo的生长能力和游动能力显著下降,产生的胞外多糖明显减少,但PhaR基因突变对Xoo的抗逆能力、抗药性和胞外脂酶活性没有影响。通过实时定量PCR分析突变体中PHA合成途径相关基因的表达情况。相比野生型,PhaR基因突变后Xoo中PHA合成相关基因PhaC、PhaD、PhaE、PhaF、Phbsub、 Phbsyn和Phbdep的表达量都显著下降,其中PHA合成中的关键酶基因PhaC的转录水平为野生型的三分之一接种寄主植物水稻后,突变体形成的病斑长度较野生型明显缩短,并且在水稻中的增殖能力显著下降。PhaR编码基因可以回补PhaR基因缺失突变体的致病性和在水稻中的增殖能力。测定其对非寄主植物烟草的过敏反应时发现,突变体激发烟草过敏反应的能力明显增强。对接种叶片进行DAB和trypan blue染色观察接种部位活性氧爆发和micro-HR,发现突变体激发烟草叶片活性氧爆发的能力增强,诱导烟草叶片细胞死亡数明显增多。运用半定量RT-PCR分析接种叶片内防卫反应相关基因的表达情况,接种烟草后5小时内,突变体诱导烟草体内HMGR和MAPK基因的表达水平较接种野生型菌增强。以上研究结果表明：PhaR基因对水稻白叶枯病菌的多种生物学特性都有明显影响;PhaR基因突变显著降低了Xoo中PHA的合成量；PhaR基因在水稻白叶枯病菌对寄主植物水稻的致病过程中起着重要作用,并且PhaR基因能够负调控Xoo在非寄主植物烟草上引起的过敏反应。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
縮略语  11-13
上篇文献综述  13-28
  第一章水稻白叶枯病菌致病相关因子的研究  14-18
    1 胞外多糖  14-16
    2 胞外酶  16-17
    3 细菌鞭毛蛋白  17-18
  第二章水稻白叶枯病菌诱导烟草过敏反应相关因子的研究  18-22
    1 活性氧在过敏反应中的作用  18-19
    2 MAPK的研究进展  19-22
  第三章聚羟基脂肪酸酯(PHA)的研究进展  22-28
    1 PHA合酶(PhaC)  23-24
    2 PHA解聚酶(PhaZ)  24-25
    3 颗粒结合蛋白PhaP  25
    4 PHA合成调控蛋白(PhaR)  25-28
下篇研究内容  28-69
  第一章 PhaR基因缺失突变体的功能互补  29-43
    摘要  29
    ABSTRACT  29-30
    1 材料与方法  30-39
    2 结果与分析  39-41
      2.1 重组载体pHMPhaR的构建  39-40
      2.2 PhaR基因缺失突变体功能互补子的获得  40-41
      2.3 菌落PCR验证  41
    3 讨论  41-43
  第二章 PhaR基因缺失突变体生物学特性的研究  43-53
    摘要  43
    ABSTRACT  43-44
    1 材料与方法  44-46
      1.1 供试菌株  44
      1.2 培养基、培养条件和抗生素  44-45
      1.3 主要试剂  45
      1.4 水稻白叶枯病菌生物学形态的研究  45-46
      1.5 水稻白叶枯病菌的抗逆能力测定  46
      1.6 水稻白叶枯病菌对杀菌剂抗药性的测定  46
      1.7 统计分析方法  46
    2 结果与分析  46-52
      2.1 PhaR基因缺失突变体生物学形态的变化  46-49
      2.2 PhaR基因缺失突变体的抗逆能力测定  49-50
      2.3 PhaR基因缺失突变体对杀菌剂的抗药性测定  50-52
    3 讨论  52-53
  第三章 PhaR基因缺失突变体中PHA代谢合成途径相关基因表达量的变化  53-59
    摘要  53
    ABSTRACT  53-54
    1 材料与方法  54-57
      1.1 供试菌株  54
      1.2 培养基、培养条件和抗生素  54
      1.3 主要试剂  54
      1.4 特异性引物的设计与合成  54-55
      1.5 细菌总RNA的提取  55-56
      1.6 反转录  56
      1.7 实时定量PCR测定PHA合成代谢途径相关基因的定量表达  56
      1.8 实时定量PCR的结果分析  56-57
    2 结果与分析  57-58
    3 讨论  58-59
  第四章 PhaR基因缺失对PX099A在水稻上的致病性和烟草过敏反应的影响  59-69
    摘要  59
    ABSTRACT  59-60
    1 材料与方法  60-64
      1.1 供试菌株和植物材料  60
      1.2 植物材料  60
      1.3 培养基、培养条件和抗生素  60
      1.4 主要试剂  60-61
      1.5 水稻白叶枯病菌对水稻致病性的测定  61
      1.6 水稻中细菌生长曲线的测定  61
      1.7 水稻白叶枯病菌对烟草过敏反应的测定  61
      1.8 Micro-HR测定  61
      1.9 活性氧爆发的测定  61
      1.10 离子电导率分析  61-62
      1.11 烟草叶片总RNA的提取和反转录  62-63
      1.12 引物的设计与合成  63
      1.13 RT-PCR  63-64
    2 结果与分析  64-68
      2.1 PhaR基因缺失突变体对水稻致病性的测定  64-65
      2.2 PhaR基因缺失突变体对烟草过敏反应的测定  65
      2.3 PhaR基因缺失突变体诱导烟草叶片产生氧爆发和micro-HR的检测  65-66
      2.4 PhaR基因缺失突变体接种烟草部位离子电导率的分析  66-67
      2.5 PhaR基因缺失突变体诱导烟草防卫反应相关基因表达量的变化  67-68
    3 讨论  68-69
全文总结  69-71
参考文献  71-79
附录  79-81
致谢  81-83
本论文研究受资助基金  83

水稻白叶枯病菌PXO99~A中PhaR基因突变对其在水稻上的致病性和烟草过敏反应的影响

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