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水稻条纹病毒mRNA转录起始机制及其NSvc2蛋白在植物细胞中的亚细胞定位研究

作　者: 姚敏
导　师: 陶小荣
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻条纹病毒转录起始抓帽机制糖蛋白亚细胞定位
分类号: S435.111
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)作为纤细病毒属的典型成员,是引起水稻条纹叶枯病的病原物,在灰飞虱体内循回并增殖,以持久方式经卵传播,在我国广大稻区已经造成了极其严重的危害。通过几十年的努力,研究者在RSV的很多方面取得了巨大的成果,如基因组结构及其编码策略和蛋白功能、病毒粒子形态、抗病育种等,但还有很多方面值得更深入地认识和研究。RSV是一个负义链RNA病毒,其RNA5’端并不存在帽子结构,而其mRNA5’末端却有一段非病毒来源的RNA序列,那么这些短的、非病毒的帽子结构的来自什么地方,又有什么规律可寻呢?另一个值得关注的问题是RSV病毒粒子形态,RSV与布尼亚病毒科病毒的亲缘关系十分近,但二者的病毒粒子形态却差别非常大,这是又是什么原因造成的呢?为了解答这两个疑惑,本研究开展了以下两方面的研究：1.水稻条纹病毒mRNA转录起始机制的研究RNA帽子结构存在于所有真核生物mRNA和大多数病毒基因组RNA的5’端,它对于RNA的有效剪切、RNA出核转运和RNA自身稳定具有重要的作用。但是分段负义链RNA病毒的RNA5’端不存在帽子结构,而其mRNA5’末端却有一段非病毒来源的RNA序列,RSV mRNA5’端同样存在这样的序列,RSV是否和其他负义链RNA病毒一样通过“抓帽”机制获得这些帽子结构。为了探明RSV mRNA5’端这些短的、非病毒的帽子结构的来源机制,本研究将RSV和具5,端帽子结构的正义链RNA病毒黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)共侵染本氏烟,结果发现前者可“窃取”后者RNA5’端的帽子结构并起始自身RNA的转录,而且优先切割在与RSV RNA3’端多碱基互补的位点。源于CMV的RNA帽子长度达到12-20nt(nucleotides)时可以起始RSV长距离转录,但长度为12-16nt的RNA前导序列最适合RSV长距离转录起始,可产生了更多的CMV-RSV嵌合体。虽然从CMV RNA切割而来的初始帽子长度较短(10-13nt),但是这些源于CMV帽子结构、可起始RSV mRNA长距离转录的RNA前导序列包含多达5个额外的AC重复。经序列分析发现这些AC重复通过引物重配机制添加到CMV RNA初始的、较短的帽子上,而且每经历一次引物重配即可增加一个AC到RNA帽子结构上,如此循环,较短的RNA帽子逐步增长至较长的帽子结构(12-20nt)。值得注意的是,源于CMV RNA1/2的初始RNA帽子(10或11nt)不可以直接进行转录延伸,只有当其帽子长度增至12nt以上才可以被用于直接延伸。这些结果表明引物重配机制可以使较短的CMV RNA帽子序列逐步增长至较长且合适长度的RSV RNA帽子结构,从而促使形成较稳定的转录起始复合体,有利于RSV RNA转录起始并长距离延伸。2. RSV NSvc2蛋白在植物细胞中的亚细胞定位研究纤细病毒属病毒与布尼亚病毒科病毒具有极高的亲缘关系,但是纤细病毒的病毒粒子呈细丝状且不具包膜,而布尼亚病毒的病毒粒子是具包膜的球状粒子。在布尼亚病毒的球状病毒粒子形成过程中其糖蛋白起了十分重要的作用,是决定病毒粒子形态的关键因子。RSV基因组RNA2的互补链vcRNA2编码的一个多聚蛋白RSV NSvc2蛋白与布尼亚病毒的糖蛋白具有很高的同源性,且具有许多共同的特征,但病毒粒子形态却截然不同,是否是其糖蛋白的特性发生改变从而导致其病毒粒子形态的变化。为了阐明这个问题,首先通过序列分析发现：RSV NSvc2蛋白具有4个跨膜区域(6-26aa、269-291aa、362-379aa和807-827aa),其中2个区域是信号肽(1-18aa和362-379aa),而且其成熟过程在382aa位点发生切割形成NSvc2-N(41kDa)和NSvc2-C (51kDa)两个成熟蛋白。为了进一步明确RSV病毒粒子形态的成因,本研究在本氏烟中更深入地研究了NSvc2的特征,结果发现：在RSV自然侵染水稻和本氏烟的过程中糖蛋白NSvc2的确发生切割,形成两个成熟蛋白NSvc2-N和NSvc2-C,而且NSvc2-N单独表达时定位于高尔基体,而NSvc2-C单独表达时却积累于内质网,但是一旦二者共同表达时,NSvc2-N即可把Svc2-C从内质网招募到高尔基体上,而且这种从内质网到高尔基体的转运是依赖有功能的细胞早期分泌途径COP I和COP Ⅱ,且定位于高尔基体的NSvc2可与高尔基体一起沿着内质网运动。进一步通过缺失和重组嵌合突变体发现NSvc2的高尔基体定位信号位于NSvc2-N的C端区域(269-315aa),涵盖了NSvc2-N跨膜区和相邻的24aa的胞浆尾部。这些结果表明RSV糖蛋白NSvc2蛋白在植物细胞中定位于高尔基体,与布尼亚病毒科病毒糖蛋白的细胞学特征相同,为RSV的认识提供了新的视角,有望寻找到RSV病毒粒子线状形态的真正成因。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
第一章文献综述  12-40
  1 水稻条纹病毒概述  12-15
    1.1 水稻条纹叶枯的分布及危害  12-15
    1.2 水稻条纹病毒的生物学特性  15
  2 RSV基因组结构及所编码的蛋白  15-20
    2.1 病毒粒体  15-16
    2.2 RSV基因组的结构  16-17
    2.3 病毒基因组编码的蛋白  17-20
  3 病毒RNA加帽机制  20-29
    3.1 帽子依赖和非帽子依赖的蛋白质翻译起始  20-21
    3.2 RNA 5’端帽子的结构及加帽过程  21-23
    3.3 病毒RNA加帽机制的多样性  23-26
    3.4 抓帽机制的研究概况  26-29
      3.4.1 抓帽机制的存在和过程  26-28
      3.4.2 抓帽机制的模型  28
      3.4.3 抓帽产生引物RNA的偏好性  28-29
  4 布尼亚病毒科膜蛋白的研究概况  29-40
    4.1 布尼亚病毒侵入、组装及释放  32-34
      4.1.1 病毒侵入  32-33
      4.1.2 病毒组装及释放  33-34
    4.2 糖蛋白GP的切割成熟  34-36
    4.3 糖蛋白GPs C端CTS的功能  36-40
      4.3.1 病毒粒子出芽释放  36-37
      4.3.2 病毒的组装  37-38
      4.3.3 其他功能  38-40
第二章水稻条纹病毒mRNA转录起始机制的研究  40-60
  摘要  40-41
  ABSTRACT  41-42
  1 材料与方法  42-48
    1.1 材料与毒源  42-43
    1.2 试验方法  43-48
      1.2.1 摩擦接种法  43
      1.2.2 总RNA的抽提  43
      1.2.3 RT-PCR反应  43-45
      1.2.4 割胶回收  45
      1.2.5 连接  45-46
      1.2.6 感受态细胞制备及转化  46
      1.2.7 菌落PCR筛选阳性克隆  46-47
      1.2.8 质粒小提  47-48
      1.2.9 测序  48
      1.2.10 序列分析  48
  2 结果与分析  48-54
    2.1 CMV RNAs可为RSV mRNA提供帽子结构  48-51
    2.2 在RSV转录起始切割CMV RNA帽子的序列偏好性  51-53
    2.3 起始RSV mRNA转录的帽子长度要求及偏好性  53-54
    2.4 重复的引物重配所“窃取”的帽子长度至适用RSV转录延伸  54
  3 讨论  54-60
第三章 RSV NSvc2蛋白在植物细胞中的亚细胞定位研究  60-86
  摘要  60-61
  ABSTRACT  61-63
  1 材料与方法  63-68
    1.1 材料与毒源  63
    1.2 试验方法  63-68
      1.2.1 摩擦接种法  63
      1.2.2 总蛋白的抽提  63
      1.2.3 Western bolt  63-64
      1.2.4 载体构建(图3-1)  64-67
      1.2.5 农杆菌转化  67
      1.2.6 农杆菌浸润  67-68
      1.2.7 显微观察  68
      1.2.8 序列分析  68
  2 结果与分析  68-82
    2.1 RSV NSvc2在本氏烟中可以发生切割  68-70
    2.2 NSvc2-N蛋白定位于高尔基体  70-71
    2.3 NSvc2-C蛋白累积在内质网膜上  71-72
    2.4 NSvc2-N蛋白把NSvc2-C从ER招募到高尔基体  72-73
    2.5 在本氏烟中NSvc2蛋白与高尔基体共运动  73-75
    2.6 糖蛋白NSvc2从ER到Golgi的转运依赖于COPⅡ复合钵  75-77
    2.7 糖蛋白NSvc2积累于Golgi依赖于COPI途径  77-79
    2.8 NSvc2-N的高尔基体定位信号位于其C端的跨膜区及其毗邻的24 aa胞浆尾部  79-82
  3 讨论  82-86
第四章全文总结  86-90
  1 全文总结  86-87
    1.1 RSV mRNA转录起始机制的研究  86-87
    1.2 RSV NSvc2蛋白在植物细胞中的亚细胞定位研究  87
  2 本研究的创新点  87-90
参考文献  90-104
附录A：本论文主要的重要缩写词及中文对照  104-106
附录B：本研究所用的引物  106-108
附录C：本研究所用缓冲液及培养基配方  108-112
附录D：常用的抗生素及使用浓度  112-114
附录E：研究生期间发表的学术论文  114-116
致谢  116

水稻条纹病毒mRNA转录起始机制及其NSvc2蛋白在植物细胞中的亚细胞定位研究

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