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水稻条纹病毒土传媒介的研究

作　者: 陈苗苗
导　师: 杨世湖
学　校: 南京农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 水稻条纹病毒胶体金土传媒介水生金黄杆菌
分类号: S435.111.42
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

水稻条纹叶枯病(rice stripe)由水稻条纹病毒(rice stripe virus, RSV)引起,是当前在我国水稻生产中分布广,发生重,为害大的重要病毒病。近年来对我国水稻生产造成严重威胁和巨大的经济损失,被称为水稻的“癌症”。1963年我国在苏南地区发生过,20世纪90年代在江苏再次发生并爆发成灾,现已相继蔓延至整个长江中下游稻区,据江苏省植保站统计,仅2004年全省有42个县发生水稻条纹叶枯病,波及面积达157万hm2,占水稻总栽培面积的79%,绝收面积达5200hm2,目前已上升为水稻生产上最主要的病害之一自水稻条纹叶枯病在中国有研究报道以来,学术界普遍认同水稻条纹叶枯病是由灰飞虱(Laodelphaxstriatellu)传播的一种虫媒病害,有关该病传播途径的研究也全部集中在灰飞虱上。然而,高效农药和连年高强度的杀虫措施似乎并没能遏制该病近年来加重的趋势。我们在对稻麦多年轮作的试验田的中注意到,水稻条纹叶枯病不仅有逐年加重的趋势而且也具备一些与土传病害类似的特征。为了确定水稻感条纹叶枯病毒病除了灰飞虱刺吸传毒外,是否存在着土传途径,我们从南京农业大学水稻所网室连年高发条纹叶枯病的稻池土壤中,分离出不同形态特征的菌株对所有这些菌株均以RSV的CP基因引物进行了PCR检查,发现有一个细菌菌株能扩增出与发病水稻叶片RNA的RT-PCR产物类似的单一和清晰的990bp±的特异性条带,而其余各种菌株都没有相应的PCR产物。将该菌株送两家不同商业测序公司进行细菌16S-rRNA测序定名,两家公司结果均为与Chryseobacterium aquaticum sp.nov.100%同源,确定该菌株为金黄杆菌属的水生金黄杆菌。采用盆栽根系接种鉴定的方法,进行了6次稻苗根系接种水生金黄杆菌试验,其中感条纹叶枯病品种(日本晴、R109、武育粳3号)共五次、抗条纹叶枯病品种(IR36)一次。接菌后逐日观察记录发病情况,结果显示感病品种的5次接菌试验的4周发病株率为12.5～35.9%,发病时间持续12天左右；而5次不接菌对照的4周发病株率仅为1.4-9.3%,。不同感病品种在不同时期的接种发病率没有太大的波动。抗条纹叶枯病品种IR36无论接菌与否均不发病。这表明用水生金黄杆菌根部接种确能诱发水稻条纹叶枯病毒病,而抗病品种的抗条纹叶枯病基因对于根部接菌也表现出了充分的抗病性。为了确定接种水生金黄杆菌后发病株是否有条纹叶枯病毒,我们对参试的所有植株都进行了RT-PCR检查。结果发现所有接种试验的发病植株不仅病状与田间自然发病株相同,而且其病叶用RSV病毒的外壳蛋白基因引物都可以扩出一条单一清晰的990 bp的条带,用RSV病毒的毒蛋白基因引物都能扩出500bp的条带,这些条带经外送商业公司测序表明是对应的条纹叶枯病毒序列。而不接菌对照和无典型心叶卷曲病状的接菌后植株除有个别的能扩出这两条带之外其余植株均没有PCR产物。而从田中取得的发病植株不同部位的叶片,检测其带毒情况发现并非所有叶片都能检测到,并且不同分蘖带毒情况也不同。由此,猜测这也是传毒媒介的不同造成的。从而初步确定,水稻条纹叶枯病也是一种土传性病害,其病原病毒的介体是水生金黄杆菌。用RSV抗血清进行免疫胶体金标记此菌样品。在菌体上可以清楚的看见金颗粒的存在。RSV抗体在水生金黄杆菌中的检测结果也充分说明了土壤传播途径的存在。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-12缩略语 12-14第一章文献综述 14-32 第一节水稻条纹病毒(RSV)与水稻条纹叶枯病 14-23 1.1 水稻条纹病毒(RSV) 14-18 1.2 RSV引起的水稻条纹叶枯病 18-22 1.2.1 水稻条纹叶枯病的流行和症状 18-19 1.2.2 水稻条纹叶枯病的危害以及防治 19-20 1.2.3 水稻品种的条纹叶枯病抗性鉴定 20-22 1.3 水稻条纹叶枯病的防治研究 22-23 1.3.1 通过化学防治来控制病害 22 1.3.2 运用抗病品种、抗病遗传和抗病育种来控制病害 22-23 1.3.3 基因工程来控制病害 23 第二节植物病毒研究现状 23-27 2.1 植物病毒的鉴定检测方法 23-26 2.1.1 生物学检测方法 23 2.1.2 清学检测方法 23-24 2.1.3 电子显微镜技术检测方法 24-25 2.1.4 基因工程检测方法 25-26 2.2 传毒介体和传毒方式 26-27 第三节土传病害研究概况 27-29 3.1 土传病害特点及其危害 27-28 3.2 土产病害的流行和防治 28-29 3.3 我国重要的水稻土传病害 29 第四节本研究的目的和意义 29-32第二章接种诱发条纹叶枯病 32-40 1 材料和方法 32-33 1.1 试验材料 32 1.1.1 供试材料 32 1.1.2 培养基 32 1.1.3 土样 32 1.2 试验方法 32-33 1.2.1 菌液的制备 32-33 1.2.2 水稻接种方法 33 2 结果与分析 33-40 2.1 土壤菌株的分离和鉴定 33-34 2.2 冬季培养箱中接种试验 34-35 2.3 夏季接种试验 35-38 2.4 水稻根系接种水生金黄杆菌后条纹叶枯病的发病进程 38-40第三章发病株叶片内RSV检测 40-48 1 材料与方法 40-43 1.1 试验材料 40-41 1.1.1 试剂 40-41 1.1.2 试剂盒 41 1.1.3 培养基 41 1.2 试验方法 41-43 1.2.1 PCR扩增 41 1.2.2 琼脂糖胶DNA产物的回收 41-42 1.2.3 连接反应与转化 42 1.2.4 质粒提取 42-43 1.2.5 植株总RNA的提取 43 2 结果与分析 43-45 2.1 水生金黄杆菌接种后发病株的RSV病毒定性检测 43-44 2.2 水稻不同部位叶片的RT-PCR检测 44-45 3 讨论 45-48第四章水生金黄杆菌内RSV的检测 48-56 1 材料与方法 48-50 1.1 试验材料 48-49 1.1.1 供试材料 48 1.1.2 供试抗血请 48 1.1.3 试剂 48-49 1.2 试验方法 49-50 1.2.1 病毒提纯和观察 49 1.2.2 电镜超薄切片制备 49 1.2.3 免疫胶体金标记样品制备 49-50 1.2.4 免疫胶体金标记程序 50 2 结果与分析 50-52 2.1 病毒的提纯 50-51 2.2 电镜超薄切片 51 2.3 免疫胶体金标记 51-52 3 讨论 52-56第五章全文结论 56-58参考文献 58-68攻读硕士期间发表的论文 68-70致谢 70

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