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MPP~+所诱导的自噬应激在细胞损伤中的作用及其机制探讨

作　者: 石际俊
导　师: 刘春风
学　校: 苏州大学
专　业: 神经病学
关键词: 自噬 自噬应激 α-synuclein MPP~+(1-甲基-4-苯基吡啶离子) 帕金森病 动力蛋白
分类号: R736.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


第一部分MPP~+诱导PC12细胞自噬应激及α-synuclein自噬性清除障碍的机制探讨目的探讨MPP~+所诱导的自噬应激在嗜铬细胞瘤(PC12)细胞损伤中的作用,MPP~+导致α-突触核蛋白(α-synuclein)自噬性清除障碍及其异常聚集的可能机制,以及不同程度的自噬应激水平与细胞损伤之间的关系。方法利用本课题组已成功构建的过表达人A30P致病突变α-synuclein的PC12细胞模型,在MPP~+处理细胞24h后,采用四甲基偶氮盐法(MTT)检测细胞活力, Western blot检测α-synuclein,微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)及动力蛋白在蛋白水平表达的变化,并用MDC染色和免疫荧光标记观察自噬水平的变化及α-synuclein、LC3-Ⅱ和溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)在细胞内的共定位情况。同时,用不同浓度MPP~+处理后观察不同自噬应激水平对α-synuclein,LC3及动力蛋白在蛋白水平表达以及细胞凋亡的影响。结果MPP~+处理后细胞的活力明显下降;与未处理组相比(PC12组:0.200±0.084;A30P组:0.758±0.085),PC12 + MPP~+组(0.660±0.072,P<0.01)和A30P + MPP~+组(1.707±0.400,P<0.001)α-synuclein表达增加;LC3-Ⅱ蛋白的表达水平及自噬泡的平均数目均增高,差异具有统计学意义;另外,MPP~+处理后,α-synuclein和LC3-Ⅱ的荧光信号及其共定位增加,尽管LAMP-1标记的溶酶体荧光信号增加,但与LC3-Ⅱ标记的自噬体共定位程度却减小。另外,不同浓度MPP~+所诱导的自噬应激对PC12细胞具有不同的影响,随着MPP~+浓度的增大自噬应激水平呈明显增高趋势,凋亡细胞增多,易聚集α-synuclein蛋白表达增加,介导自噬体与溶酶体融合的关键马达蛋白——动力蛋白表达减少。结论MPP~+所诱导的自噬应激与动力蛋白功能受损引起α-synuclein自噬性清除障碍密切相关,这表明动力蛋白功能障碍在细胞损伤中具有重要作用,动力蛋白可能是α-synuclein自噬性降解调控中的关键靶点。第二部分动力蛋白:自噬应激形成的关键调节靶点目的探讨动力蛋白介导的α-synuclein降解障碍在自噬应激形成中的作用及其机制,为PD的防治提供新的治疗策略和可调控靶点。方法利用siRNA的方法构建敲减动力蛋白的细胞模型,然后采用免疫细胞化学及Western blot的方法观察α-synuclein表达和自噬水平的变化,并采用透射电镜观察细胞超微结构改变以及自噬的形态学改变;采用腹腔注射的方法构建鱼藤酮诱导的PD大鼠模型,用Western blot的方法对鱼藤酮诱导的PD大鼠纹状体动力蛋白、α-synuclein和自噬的改变进行观察分析。结果通过siRNA技术干扰动力蛋白的功能会导致α-synuclein的明显聚集(P<0.01);鱼藤酮处理后动力蛋白表达下降(P<0.01),α-synuclein表达增多和聚集(P<0.01),LC3-Ⅱ表达增多(即自噬体增多)(P<0.05),mTOR磷酸化水平下降(即抑制mTOR上调自噬)(P<0.05),这表明鱼藤酮处理引起动力蛋白功能障碍导致α-synuclein的聚集增加以及自噬体的形成增加(即自噬应激水平增加),mTOR参与此自噬诱导的过程。结论动力蛋白介导α-synuclein的自噬性降解,其功能障碍介导α-synuclein聚集和自噬体的积聚,因此动力蛋白通过自噬调控α-synuclein的降解而成为PD防治中潜在的调节靶点。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
序言  10-22
第一部分 MPP+诱导PC12 细胞自噬应激及α-synuclein 自噬性清除障碍的机制探讨  22-44
  材料和方法  25-30
  结果  30-38
  讨论  38-40
  参考文献  40-44
第二部分 动力蛋白：自噬应激形成的关键调节靶点  44-65
  材料和方法  45-53
  结果  53-57
  讨论  57-60
  参考文献  60-65
结论  65-66
综述  66-87
  综述一 自噬在帕金森病发病中的作用  66-75
  综述二 α-synuclein 和自噬在帕金森病中的作用  75-87
英汉主要缩略词表  87-89
在读期间撰写论文、科研以及获奖情况  89-92
致谢  92-95

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 内分泌腺肿瘤 > 肾上腺肿瘤
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