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应用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系在sf9细胞中重组表达保守性多巴胺能神经营养因子

作　者: 张俊
导　师: 牛朝诗；傅先明
学　校: 安徽医科大学
专　业: 外科学
关键词: 杆状病毒表达系统保守性多巴胺能神经营养因子杆状病毒转移载体杆粒帕金森病
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:应用bac-to-bac杆状病毒表达体系在sf9昆虫细胞中表达重组CDNF蛋白。方法:应用Trizol法提取小鼠组织总RNA,RT-PCR扩增得到小鼠CDNF基因全长(564bp)片段,将CDNF基因插入至转座载体pFastBacHTb中,构建重组质粒pFastBacHTb-CDNF,然后转化到E.coli DH5α感受态细胞中,以LB/Amp平板筛选阳性重组子,并经PCR、酶切及测序验证以保证重组载体的正确及可靠性;将杆状病毒转移载体pFasBacHTb-CDNF转化到DH10Bac E.coli(自带杆粒及辅助质粒)感受态细胞中,通过转座作用将目的片段整合到杆粒中,抗性及蓝白斑筛选法筛选出重组杆状病毒载体Bacmid-CDNF,使用CDNF特异引物及PUC/M13杆粒测序引物对重组杆粒进行验证;参照CELLFECTINⅡ脂质体转染剂操作说明,将重组Bacmid-CDNF杆粒转染sf9昆虫细胞,并在光学显微镜下观察细胞形态学变化,以判断转染的成功性;转染成功后,收集P1代病毒液,继续感染sf9细胞,可获取P2代和P3代病毒液,应用P3代病毒诱导重组CDNF蛋白的表达,并应用Western blot对重组蛋白的表达进行验证。结果: (1)RT-PCR结果经琼脂糖凝胶电泳显示,成功获取564bp大小的CDNF目的基因片段,重组质粒pFastBacHTb-CDNF经PCR、酶切及基因测序验证均正确无误;(2)重组转移载体pFastBacHTb-CDNF转化DH10Bac感受态细胞后,阳性bacmid-CDNF重组子经CDNF特异引物及pUC/M13杆粒测序引物PCR验证可分别获取561bp及3000bp大小目的片段,均与理论大小相符,表明杆粒构建成功;(3)重组杆粒通过Cellfectin转染剂转染sf9昆虫细胞,转染48~72后,sf9细胞细胞直径逐渐增大,细胞渐脱离贴壁培养状态,随之,细胞渐渐肿胀,种种迹象均表明,杆粒转染成功,收获杆状病毒液;(4)P3代杆状病毒液感染sf9细胞,诱导重组CDNF蛋白表达,经Western blot验证,目的蛋白成功诱导表达,并符合预计大小(21KD)。结论:通过bac-to-bac杆状病毒表达系统成功诱导CDNF重组蛋白的表达。

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主要缩略词 6-7中文摘要 7-9Abstract 9-11前言 11-13第一部分 CDNF 杆状病毒转移载体的构建与鉴定 13-30 1 材料与方法 13-28 1.1 材料 13-16 1.2 方法 16-22 1.3 结果 22-26 1.4 结论 26 1.5 讨论 26-28 参考文献 28-30第二部分 CNDF 重组杆状病毒表达载体的构建及重组 CDNF 蛋白在 sf9 细胞中的表达及鉴定 30-45 1. 材料与方法 30-43 1.1 材料 30-32 1.2 方法 32-36 1.3 结果 36-40 1.4 结论 40 1.5 讨论 40-43 参考文献 43-45第三部分 pDsRed2-C1-CDNF真核表达载体的构建及其在大鼠MSCs原代细胞中的表达 45-53 1. 材料及方法 45-52 1.1 材料 45-46 1.2 方法 46-47 1.3 结果 47-50 1.4 结论 50 1.5 讨论 50-52 参考文献 52-53附录 53-55致谢 55-56综述 56-64 参考文献 62-64

应用Bac-to-Bac杆状病毒表达体系在sf9细胞中重组表达保守性多巴胺能神经营养因子

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