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鲢鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的制备及其糖基化产物功能特性的研究

作　者: 尤娟
导　师: 罗永康；吴建平
学　校: 中国农业大学
专　业: 水产品加工及贮藏工程
关键词: 鲢鱼鱼肉蛋白 抗氧化活性肽 分离纯化 糖基化反应 功能特性
分类号: TS254.1
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


鲢鱼是我国主要的淡水鱼种,其生长快,产量大,但其特有腥味,骨刺多等造成鲢鱼低价值。近来,有关如何提高鲢鱼附加值的问题已成为国内水产加工研究者们研究和开发产品的热点,但仍然处在初级阶段。因此,本研究以鲢鱼鱼肉蛋白为原料,采用酶解的方法制备抗氧化活性肽,并通过糖基化作用对酶解产物和水溶性蛋白进行功能特性和抗氧化活性改性的研究,为鲢鱼蛋白综合加工和提高其附加值提供理论基础。本研究选择了五种蛋白酶酶解鲢鱼鱼肉蛋白,通过测定了鲢鱼鱼肉蛋白的水解度及酶解产物的抗氧化活性,并分析了水解度与抗氧化各指标间的相关性。结果表明,胃蛋白酶酶解产物的清除DPPH自由基能力和还原力较强：另外,酶解产物的水解度与亚铁离子螯合力具有显著的相关性(p<0.05)。通过超滤、凝胶过滤层析与反相高效液相色谱(RP-HPLC)相结合的方法对鲢鱼鱼肉蛋白多肽进行分离,并运用清除DPPH自由基、清除羟基自由基、亚铁离子螯合力、还原力及氧活性自由基吸收能力(ORAC)等方法测定其抗氧化活性。通过液质联用的方法鉴定了10个来源于鲢鱼肌球蛋白和肌动蛋白的肽,经过合成后测定了其抗氧化活性,其中有两个肽Tyr-Thr-Ile-Gln-Tyr(YTIQY)和Asn-Trp-Asp-Asp-Met (NWDDM)抗氧化活性较高,且高于相同浓度的茶多酚的ORAC值。鲢鱼鱼肉蛋白多肽和葡萄糖在不同温度和质量比的条件下经过糖基化改性制备鲢鱼鱼肉蛋白多肽-糖复合物。糖基化反应产物有较好的清除DPPH自由基能力和还原力,显著高于未经过糖基化反应的多肽(p<0.05)。当鲢鱼鱼肉蛋白多肽与葡萄糖在60℃,以2：1混合反应后其产物显现出较高的褐变程度和抗氧化活性,且294nm的吸光值与抗氧化活性之间具有显著的相关性(p<0.05)。因此糖基化改性技术可以在一定程度上提高鲢鱼鱼肉蛋白多肽的抗氧化活性。鲢鱼水溶性蛋白在鱼糜加工过程中被作为废水处理,为了更好的利用鲢鱼水溶性蛋白资源,研究了鲢鱼水溶性蛋白经过热加工、冷冻干燥以及不同pH条件处理下的鲢鱼水溶性蛋白的溶解性、乳化性、起泡性、热稳定性等功能特性和理化特性。结果表明,鲢鱼水溶性蛋白在40℃到55℃之间经历了变性和聚集,在50℃时变化速率最大。组成鲢鱼水溶性蛋白的蛋白质分子量主要集中在30～97kDa,大部分水溶性蛋白在55℃发生沉淀。经过冷冻干燥的水溶性蛋白溶解性降低至72%左右。在等电点时,鲢鱼水溶性蛋白的功能特性较差。鲢鱼水溶性蛋白在加热过程中容易发生变性聚集而降低其各方面功能特性,本研究将5种糖基供体(包括木糖、葡萄糖、半乳糖、低聚异麦芽糖、葡聚糖-10)引入到鲢鱼水溶性蛋白,经过糖基化反应后测定其产物的功能特性,包括溶解性、热稳定性、乳化活性、乳化稳定性,同时将其理化特性如表面疏水性、总巯基含量及SDS-PAGE电泳进行分析。结果表明：经过糖基化改性的鲢鱼水溶性蛋白在50℃条件下的溶解性、乳化活性、热稳定性得到提高。并且随着提供的糖基供体分子量的增大,溶解性、乳化活性及热稳定性有一定程度的增加。综合得出鲢鱼水溶性蛋白与葡聚糖-10的反应产物具有较好效果。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
縮略词表  7-12
第一章 绪论  12-29
  1.1 引言  12-13
  1.2 鱼肉蛋白质的组成及研究现状  13-16
    1.2.1 盐溶性蛋白质  13-15
    1.2.2 水溶性蛋白  15-16
    1.2.3 不溶性蛋白  16
  1.3 蛋白质的改性  16-17
  1.4 蛋白质酶法改性制备抗氧化肽的研究现状  17-21
    1.4.1 酶法改性概述及改性程度  17
    1.4.2 酶解改性产物分离纯化的研究现状  17-18
    1.4.3 酶解产物抗氧化活性的研究现状  18-19
    1.4.4 抗氧化肽结构与功能关系的研究现状  19-21
    1.4.5 抗氧化肽应用的研究现状  21
  1.5 蛋白糖基化改性的研究现状  21-27
    1.5.1 糖基化改性的基本原理  22
    1.5.2 糖基化改性方法的研究现状  22-23
    1.5.3 糖基化改性程度的研究现状  23-24
    1.5.4 糖基化改性产物功能特性的研究现状  24-25
    1.5.5 糖基化改性产物结构的研究现状  25-27
  1.6 本课题的研究目的及意义  27
  1.7 本课题的主要内容  27-29
第二章 酶法制备鲢鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的研究  29-38
  2.1 前言  29
  2.2 材料和设备  29-30
    2.2.1 主要材料  29-30
    2.2.2 主要设备  30
  2.3 试验方法  30-32
    2.3.1 鲢鱼蛋白匀浆液的制备  30
    2.3.2 蛋白质浓度测定  30
    2.3.3 酶活力的测定  30-31
    2.3.4 鲢鱼鱼肉蛋白酶解物的制备  31
    2.3.5 鲢鱼鱼肉酶解液水解度的测定  31-32
    2.3.6 鲢鱼鱼肉酶解物清除DPPH自由基的测定  32
    2.3.7 鲢鱼鱼肉酶解物亚铁离子螯合力的测定  32
    2.3.8 鲢鱼鱼肉酶解物还原力的测定  32
    2.3.9 数据处理  32
  2.4 结果与分析  32-36
    2.4.1 鲢鱼匀浆的蛋白质浓度  32
    2.4.2 酶解时间和酶的种类对鲢鱼鱼肉蛋白水解度的影响  32-33
    2.4.3 酶解时间对鲢鱼鱼肉蛋白酶解产物清除DPPH自由基的影响  33-34
    2.4.4 酶解时间对鲢鱼鱼肉蛋白酶解物亚铁离子螯合力的影响  34-35
    2.4.5 酶解时间对鲢鱼鱼肉蛋白酶解产物还原力的影响  35
    2.4.6 酶解产物水解度及抗氧化方法间相关性分析  35-36
  2.5 讨论  36-37
  2.6 小结  37-38
第三章 鲢鱼鱼肉蛋白肽的分离及其抗氧化活性的研究  38-53
  3.1 前言  38
  3.2 材料和设备  38-40
    3.2.1 主要材料  38-39
    3.2.2 试验设备  39-40
  3.3 实验方法  40-44
    3.3.1 鲢鱼鱼肉蛋白多肽的制备  40-41
    3.3.2 鲢鱼鱼肉蛋白多肽的超滤分离  41
    3.3.3 鲢鱼鱼肉蛋白多肽的Sephadex G-25凝胶层析分离  41
    3.3.4 鲢鱼鱼肉蛋白多肽的反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离  41-42
    3.3.5 鲢鱼鱼肉蛋白多肽的LC-MS/MS  42
    3.3.6 鲢鱼鱼肉蛋白多肽抗氧化活性的分析  42-43
    3.3.7 数据统计分析  43-44
  3.4 结果与分析  44-52
    3.4.1 鲢鱼鱼肉蛋白多肽超滤及其组分的抗氧化活性  44-46
    3.4.2 鲢鱼鱼肉蛋白多肽的Sephadex G25凝胶过滤层析  46-47
    3.4.3 鲢鱼鱼肉蛋白多肽反相高效液相色谱分离  47-49
    3.4.4 鲢鱼鱼肉蛋白抗氧化肽氨基酸的鉴定  49-52
  3.5 小结  52-53
第四章 鲢鱼鱼肉蛋白多肽糖基化改性的研究  53-62
  4.1 前言  53
  4.2 材料和设备  53-54
    4.2.1 主要材料  53-54
    4.2.2 主要设备  54
  4.3 试验方法  54-56
    4.3.1 鲢鱼鱼肉蛋白多肽的制备  54
    4.3.2 鲢鱼鱼肉蛋白多肽-葡萄糖复合物的制备  54-55
    4.3.3 鲢鱼鱼肉蛋白多肽-葡萄糖复合物pH的测定  55
    4.3.4 糖基化反应中间产物和褐变程度的测定  55
    4.3.5 清除ABTS~(·+)自由基的测定  55
    4.3.6 清除DPPH自由基的测定  55
    4.3.7 亚铁离子螯合力的测定  55
    4.3.8 还原力的测定  55-56
    4.3.9 统计分析  56
  4.4 结果与分析  56-61
    4.4.1 糖基化反应产物pH的变化  56-57
    4.4.2 糖基化反应中间产物的生成及褐变程度  57-58
    4.4.3 糖基化反应产物清除自由基能力  58-59
    4.4.4 糖基化反应产物亚铁离子螯合力  59-60
    4.4.5 糖基化反应产物还原力  60
    4.4.6 糖基化反应产物各指标的相关性分析  60-61
  4.5 小结  61-62
第五章 鲢鱼水溶性蛋白理化特性及功能特性的研究  62-75
  5.1 前言  62
  5.2 材料和设备  62-63
    5.2.1 主要材料  62-63
    5.2.2 主要设备  63
  5.3 试验方法  63-66
    5.3.1 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白的制备  63
    5.3.2 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白的加工处理  63-64
    5.3.3 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白溶解性的测定  64
    5.3.4 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白乳化性的测定  64
    5.3.5 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白起泡性的测定  64-65
    5.3.6 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白总巯基含量的测定  65
    5.3.7 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白表面疏水性的测定  65
    5.3.8 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白SDS-PAGE  65-66
    5.3.9 统计分析  66
  5.4 结果与分析  66-73
    5.4.1 热处理对鲢鱼鱼肉水溶性蛋白溶解性及理化性的研究  66-69
    5.4.2 冷冻干燥对鲢鱼鱼肉水溶性蛋白溶解性及理化性的研究  69-70
    5.4.3 不同pH条件下鲢鱼鱼肉水溶性蛋白功能特性及理化性的研究  70-73
  5.5 小结  73-75
第六章 鲢鱼水溶性蛋白糖基化改性的研究  75-86
  6.1 前言  75
  6.2 材料和设备  75-76
    6.2.1 主要材料  75-76
    6.2.2 主要设备  76
  6.3 试验方法  76-79
    6.3.1 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白的制备  76-77
    6.3.2 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白糖基化产物的制备  77
    6.3.3 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白糖基化产物氨基酸组成的测定  77-78
    6.3.4 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白糖基化产物溶解性的测定  78
    6.3.5 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白糖基化产物热稳定性的测定  78
    6.3.6 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白糖基化产物乳化性的测定  78-79
    6.3.7 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白糖基化产物总巯基含量的测定  79
    6.3.8 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白糖基化产物表面疏水性的测定  79
    6.3.9 鲢鱼鱼肉水溶性蛋白糖基化产物SDS-PAGE  79
    6.3.10 统计分析  79
  6.4 结果与分析  79-85
    6.4.1 氨基酸组成的变化  79-81
    6.4.2 溶解性和热稳定性的变化  81-82
    6.4.3 乳化活性和乳化稳定性的变化  82-83
    6.4.4 表面疏水性的变化  83-84
    6.4.5 总巯基含量的变化  84
    6.4.6 SDS-PAGE  84-85
  6.5 小结  85-86
第七章 结论与展望  86-88
  7.1 结论  86-87
  7.2 创新点  87
  7.3 展望  87-88
参考文献  88-107
致谢  107-108
个人简介  108-110

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 水产加工工业 > 基础科学
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