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克氏原螯虾过敏原的性质研究

作　者: 陈亨莉
导　师: 刘光明
学　校: 集美大学
专　业: 微生物学
关键词: 克氏原螯虾过敏组分鉴定分离纯化理化性质分子特性
分类号: R593.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

近年来，随着克氏原螯虾年产量及消费量的快速增长，因食用克氏原螯虾而导致过敏的病例时有发生，影响着克氏原螯虾的食用安全性及国民的身体健康。因此，开展克氏原螯虾过敏原的研究显得迫切而有意义。本文以克氏原螯虾为研究对象，分析其过敏组分，重点完成过敏原的分离纯化及性质分析，探讨加工处理方法对过敏原致敏性的影响，为开发低致敏性或无致敏性的产品提供重要理论依据。利用27份甲壳类过敏患者血清，通过Western-blotting技术，检测出克氏原螯虾肌肉中40kDa、22kDa及36kDa的蛋白为其过敏组分。采用硫酸铵盐析、离子交换柱层析的方法从克氏原螯虾肌浆中分离纯化出40kDa的的过敏组分，并应用兔抗拟穴青蟹AK多克隆抗体鉴定其为精氨酸激酶（arginine kinase，AK）。其性质研究结果显示，AK是糖含量为0.60%的糖蛋白；对热不稳定，高温处理可以降低其IgE结合活性；对酸不稳定，强碱对其IgE结合活性有一定的影响；AK对胰液具有耐受性；AK具有复杂的空间结构，同时存在线性抗原表位和构象抗原表位。此外，蒸煮处理能有效降低其IgE结合活性。采用硫酸铵盐析、柱层析的方法从克氏原螯虾肌浆中分离纯化出22kDa的过敏组分，并通过MALDI MS鉴定其为肌质钙结合蛋白（sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）；其性质研究结果表明，SCP是一种糖含量为4.90%的糖蛋白；对热稳定，在强酸碱条件下均不被降解，其热处理及酸碱处理产物的IgE结合活性并没有降低；能被消化酶所降解；SCP具有多态性， SCP-II的IgE结合活性较弱，SCP含有a、b、c三种亚基，均有IgE结合活性；SCP含有较多的转角及卷曲结构，易于形成抗原表位。采用制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸铵盐析、柱层析等方法从克氏原螯虾肌原纤维中分离纯化出36kDa的过敏组分，并应用兔抗拟穴青蟹TM多克隆抗体鉴定其为原肌球蛋白（tropomyosin，TM）。其性质研究结果显示，TM的糖含量为1.14%，对热稳定；对酸碱具有耐受性；能被消化酶所降解；TM是由α-螺旋构成的简单的超螺旋结构，以线性表位居多。肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）和血蓝蛋白（hemocyanin，HMC）是虾类的新型过敏原。本文先对其进行分离纯化，再利用9份甲壳类过敏患者血清进行确认。采用制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸分级盐析及柱层析方法从克氏原螯虾肌原纤维中分离纯化出18kDa的MLC，并通过MALDI MS进行鉴定。利用甲壳类过敏患者血清检测，初步判断MLC为克氏原螯虾的过敏原。其性质研究结果显示，MLC的糖含量为4.30%；对热稳定；在强酸碱性条件下均不被降解；但能被消化酶所降解。MLC主要由α-螺旋和卷曲组成，含有很少的β-折叠和转角，且同时具有线性抗原表位和构象抗原表位。采用离心及凝胶柱层析的方法从克氏原螯虾血淋巴中分离纯化出HMC，并应用兔抗凡纳滨对虾HMC多克隆抗体进行鉴定，结果表明，HMC是由68、72、76、82、84和88kDa六个亚基组成的六聚体。利用甲壳类过敏患者血清检测，初步判断HMC为克氏原螯虾的一种过敏原。其性质分析结果显示，HMC的糖含量为1.99%；对热稳定；对酸不稳定；对胰液耐受性。TM、MLC及SCP具有相似的理化性质，都是热稳定性蛋白，对酸碱稳定，都能被消化酶消化；AK和HMC二者的理化性质较为相近，均对酸不稳定，能耐胰液消化。AK、SCP、MLC空间结构比TM复杂。通过血清学实验、性质分析结果表明TM是克氏原螯虾的主要过敏原，AK、SCP是克氏原螯虾的重要过敏原，初步推断MLC和HMC是克氏原螯虾的潜在过敏原，但克氏原螯虾中可能还存在其他的过敏组分。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第1章引言  11-18
  1.1 食物过敏  11-12
  1.2 食物过敏原  12-15
    1.2.1 常见的食物过敏原  12-13
    1.2.2 食物过敏原的一般特性  13
    1.2.3 过敏原的基因克隆及生物信息学分析  13-14
    1.2.4 加工处理方式对食物过敏原的影响  14-15
  1.3 甲壳类动物过敏原的研究现状  15-16
  1.4 本研究的目的及意义  16-18
第2章材料与方法  18-30
  2.1 材料  18-22
    2.1.1 原材料  18
    2.1.2 血清  18
    2.1.3 主要试剂  18-20
    2.1.4 主要仪器设备  20
    2.1.5 溶液配制  20-22
  2.2 方法  22-30
    2.2.1 克氏原螯虾过敏组分的分析  22-23
    2.2.2 过敏原的纯化与鉴定  23-25
    2.2.3 过敏原的理化性质分析  25-27
    2.2.4 过敏原的基因克隆及生物信息学分析  27-28
    2.2.5 过敏原的多克隆抗体制备与检测  28
    2.2.6 加工处理对纯化过敏原的影响  28-30
第3章结果与分析  30-71
  3.1 克氏原螯虾肌肉过敏组分的分析  30-31
    3.1.1 肌浆蛋白中过敏组分的鉴定  30-31
    3.1.2 肌原纤维蛋白中过敏组分的鉴定  31
  3.2 AK 的性质研究  31-42
    3.2.1 肌浆中 40 kDa 过敏组分的纯化与鉴定  31-33
    3.2.2 AK 的理化性质分析  33-37
    3.2.3 AK 的基因克隆及生物信息学分析  37-40
    3.2.4 加工处理对 AK 的影响  40-42
  3.3 SCP 的性质研究  42-53
    3.3.1 肌浆中 22 kDa 过敏组分的纯化与鉴定  42-46
    3.3.2 SCP 的理化性质分析  46-51
    3.3.3 SCP 的生物信息学分析  51-52
    3.3.4 SCP 的多克隆抗体制备及检测  52-53
  3.4 TM 的性质研究  53-58
    3.4.1 肌原纤维中 36 kDa 过敏组分的纯化与鉴定  53-55
    3.4.2 TM 的理化性质分析  55-57
    3.4.3 TM 的生物信息学分析  57-58
  3.5 MLC 的性质研究  58-66
    3.5.1 肌原纤维中 MLC 的纯化与鉴定  58-61
    3.5.2 MLC 的 IgE 结合活性分析  61-62
    3.5.3 MLC 的理化性质分析  62-64
    3.5.4 MLC 的基因克隆及生物信息学分析  64-66
  3.6 HMC 的性质研究  66-71
    3.6.1 血淋巴中 HMC 的纯化与鉴定  67
    3.6.2 HMC 的 IgE 结合活性分析  67-68
    3.6.3 HMC 的理化性质分析  68-71
第4章讨论与结论  71-79
  4.1 AK 的性质研究  71-72
  4.2 SCP 的性质研究  72-73
  4.3 TM 的性质研究  73-74
  4.4 MLC 的性质研究  74-75
  4.5 HMC 的性质研究  75
  4.6 五种过敏原的分析比较  75-77
  4.7 结论与展望  77-79
致谢  79-80
参考文献  80-86
在学期间发表的学术论文和专利  86

克氏原螯虾过敏原的性质研究

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