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镉抗性细菌Cupriavidus campinensis KQ46的分离鉴定及其镉抗性机制研究

作　者: 朱宇辰
导　师: 盛下放
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 镉抗性机制转座子插入突变基因克隆 fcuA Cupriavidus campinensis
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着经济发展,重金属镉污染的问题日益严重,不断威胁着生态环境和人类健康。微生物在镉污染修复和治理中具有巨大的应用价值,而微生物镉抗性的高低是其应用范围的一个决定性因素,研究微生物的镉抗性机制可以为微生物更好应用于镉污染治理与修复提供理论支持。从南京市栖霞山铅锌矿区的镉污染土壤及其附近生长的镉超富集植物龙葵中共分离到72株镉抗性细菌,其中34株分离自土壤,20株分离自龙葵根部,18株分离自龙葵茎。测定了菌株对镉的最大耐受浓度(MTC)和抗生素抗性,并对菌株的16SrDNA序列进行了测定和比对,发现菌株KQ46可以耐受的Cd2+浓度为4mM,对卡那霉素和庆大霉素敏感,确定以菌株KQ46为寻找镉抗性相关基因的出发菌株。结合形态学观察和生理生化实验,初步鉴定KQ46为Cupriavidus campinensis。以KQ46为供试菌株,利用mini-mariner转座子对其进行了随机插入突变,从5000个突变子中筛选到10株可以稳定生长且镉抗性能力降低突变株,镉耐受浓度分别由4mM降低到0.8-1.0mM。利用SEFA PCR方法扩增了每个突变株中转座子的侧翼序列,通过同源性比对分析,发现有6株突变株的转座子插入的基因分别与aroG、ppd、alkK、ppc、细胞色素c533合成基因以及Acyl-CoA转移酶基因高度同源,这6个基因均为基础生长代谢所需要的基因；其余4株突变株中转座子插入失活的基因分别可能为：hmp,与细胞抗逆性反应相关；hmyF,为重金属离子外排的辅助蛋白；组氨酸激酶基因,与细胞信号转导有关；fcuA,铁色素-铁离子复合物的受体蛋白。参考前人的研究结果后,认为fcuA可能与胞内Cd2+浓度调节有关,通过sau3Al随机酶切建库的方法获得了KQ46中fcuA基因的全序列(GenBank Accession No. KC776916)及其部分侧翼序列,构建了MT21的fcuA基因回补菌株DRfcuA。通过测定培养过程中菌株KQ46胞内Cd2+含量和培养基中Cd2+浓度并结合红外光谱分析,发现胞内和胞外Cd2+浓度在培养过程中基本维持恒定,培养12h和24h胞内镉含量分别为0.548±0.016mg/g和0.552±0.008mg/g,进入衰亡期后细胞对Cd2+吸收增多,含量为1.038±0.046mg/g,而红外光谱分析显示细胞表面并没有明显吸附有Cd2+,由此认为菌株KQ46主要依靠外排Cd2+来维持胞内Cd2+含量处于可耐受范围,从而产生镉抗性。同时对MT21和DRfcuA研究后发现虽然MT21和DRfcuA对镉的最大耐受浓度均为0.8mM,但在含有0.5mM Cd2+的培养条件下从扫描电镜照片可以看出0.5mM Cd2+对MT21毒害作用比DRfcuA明显,DRfcuA吸收的Cd2+仅为MT21的50%左右,不过仍然显著高于KQ46的吸收量,同时红外光谱分析显示在含有0.5mM Cd2+的培养条件下MT21和DRfcuA的细胞在1735cm-1处具有红外吸收峰,推测可能为细胞表面的酮、醛、酯类中的C=O键与Cd2+结合所致。由此分析认为fcuA基因在Cupriavidus campinensis KQ46中具有调控胞内Cd2+含量的功能,但仍需要其上下游基因的共同作用,其具体作用机制还有待进一步研究。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章文献综述  10-24
  1. 镉污染的现状及危害  10-12
    1.1 镉的性质  10
    1.2 镉在环境中的污染状况  10-11
    1.3 镉污染的危害  11-12
  2. 镉污染的治理  12-15
    2.1 化学修复方法  13
    2.2 物理修复方法  13-14
    2.3 生物修复方法  14-15
  3. 微生物的镉抗性产生机制  15-20
    3.1 改变细胞膜对镉离子的通透性  16
    3.2 络合镉离子  16-17
    3.3 镉离子外排  17-20
  4. Cupriavidus sp.镉抗性机制的研究进展  20-22
  5. 立题依据与研究意义  22-24
第二章镉抗性细菌的分离筛选  24-38
  1. 材料  24
    1.1 样品来源  24
    1.2 培养基与试剂  24
  2. 方法  24-30
    2.1 镉抗性菌株的分离筛选  24-25
    2.2 菌株对镉最大耐受浓度的测定  25
    2.3 菌株对抗生素抗性实验  25
    2.4 菌株鉴定  25-28
    2.5 不同培养条件菌株KQ46生长的影响  28
    2.6 菌株KQ46的生物学特性  28-30
  3. 结果与分析  30-35
    3.1 镉抗性菌株的筛选  30
    3.2 菌株对镉的抗性测定  30-32
    3.3 菌株对抗生素的抗性测定  32
    3.4 菌株鉴定  32-33
    3.5 不同培养条件菌株KQ46生长的影响  33-34
    3.6 菌株KQ46的生物学特性  34-35
  4. 讨论  35-36
  5. 本章小结  36-38
第三章 Cupriavidus campinensis KQ46镉抗性突变株的筛选  38-46
  1. 材料  38-39
    1.1 菌株与质粒  38
    1.2 培养基与试剂  38-39
  2. 方法  39-41
    2.1 接合实验构建KQ46突变株文库  39
    2.2 镉抗性降低突变株的筛选  39
    2.3 突变株转座子插入位点的确定  39-41
  3. 结果与分析  41-43
    3.1 Cupriavidus campinensis KQ46镉抗性降低突变株的获得  41
    3.2 突变株转座子插入位点的确定  41-43
  4. 讨论  43-44
  5. 本章小结  44-46
第四章镉抗性相关基因fcuA的克隆及其对Cupriavidus campinensis KQ46镉抗性的影响  46-62
  1. 材料  46-47
    1.1 菌株与质粒  46-47
    1.2 培养基与试剂  47
  2. 方法  47-52
    2.1 亚克隆获得MT21转座子两翼序列  47-49
    2.2 fcuA缺失突变株的构建  49-50
    2.3 fcuA回复突变株DRfcuA的构建  50
    2.4 fcuA对Cupriavidus campinensis KQ46生理代谢的影响  50-51
    2.5 fcuA对Cupriavidus campinensis KQ46镉抗性的影响  51-52
  3. 结果与分析  52-59
    3.1 亚克隆获得MT21转座子两翼序列  52-53
    3.2 fcuA缺失突变株的构建  53-54
    3.3 fcuA回复突变株DRfcuA的获得  54-55
    3.4 fcuA对Cupriavidus campinensis KQ46生理代谢的影响  55
    3.5 fcuA对Cupriavidus campinensis KQ46镉抗性的影响  55-59
  4. 讨论  59-61
  5. 本章小结  61-62
全文总结  62-64
本文创新之处  64-66
参考文献  66-74
附录  74-80
  一、培养基配方  74-75
  二、主要试剂配方  75-76
  三、主要仪器  76
  四、引物序列  76-77
  五、DNA序列  77-80
致谢  80

镉抗性细菌Cupriavidus campinensis KQ46的分离鉴定及其镉抗性机制研究

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