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2株海洋真菌对间苯二甲酸二甲酯和甲醛的降解特性研究

作　者: 丁杰飞
导　师: 郑天凌；骆祝华
学　校: 厦门大学
专　业: 微生物学
关键词: 海洋真菌苯二甲酸酯酯酶甲醛生物降解
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

苯二甲酸酯(PAEs)作为塑料产品中的增塑剂已被发现具有内分泌干扰毒性。随着塑料工业的发展,这类物质对海洋生态环境造成巨大的威胁。在之前的研究中,我们从近海红树林沉积物中富集分离到1株PAEs的降解真菌Fusarium sp.DMT-5-3,其对不同同分异构体的邻苯二甲酸二甲酯(DMPEs)的降解途径有很大的差异,暗示其产生的DMPEs降解酯酶具有很高的底物选择性。本论文以间苯二甲酸二甲酯(DMI)为底物,诱导Fusarium sp.DMT-5-3产酶,通过离子交换层析、分子筛凝胶层析等方法分离纯化到一个DMI的降解酯酶蛋白。纯化的DMI酯酶蛋白分子量约76kDa,是由两个相同亚基组成的二聚体蛋白；酶蛋白在50℃表现出最大的酯酶活性,低于40℃时酶活较稳定；酶的最适pH为8.0,在pH6.0-12.0之间较稳定；Cr3+、Cu2+、Hg2+等金属离子强烈抑制酯酶活性,而Mg2+、Ca2+、Sr2+等金属离子能够促进酯酶活性；底物特异性分析表明该DMI酯酶能够水解间位与对位的苯二甲酸二甲酯,而对于邻位的二甲酯以及单甲酯的三种同分异构体均无水解能力,体现了很高的底物选择性。酶学性质比较显示该DMI酯酶与我们之前利用对苯二甲酸二甲酯(DMT)为底物获得的DMT酯酶完全不同,表明海洋真菌Fusarium sp. DMT-5-3可以产生不同的酯酶参与到DMPEs不同同分异构体的水解当中。甲醛(HCHO)作为消毒剂广泛应用于海洋水产养殖业中,其能与蛋白和核酸产生非特异性反应,因而对大多数海洋生物具有很强的毒性。本论文从从东太平洋深海沉积物中分离得到一株甲醛降解真菌DY-F2,通过分生孢子显微观察和18SrRNA基因序列分析结合,将其鉴定为Penicillium chrysogenum DY-F2。该菌株表现出高甲醛耐受力,能在甲醛浓度高达3000mg/L的条件下生长。1000mg/1甲醛存在下,真菌Penicillium chrysogenum DY-F2的最适生长温度为25℃,最适生长pH值是6.0。该菌株能以甲醛作为唯一碳源和能源,经由中间代谢物甲酸完全降解甲醛。甲醛的真菌降解符合一级反应动力学模型。本研究表明,深海沉积物真菌具有海洋环境中甲醛污染生物修复的应用潜力。

全文目录

缩略词  12-13
摘要  13-14
Abstract  14-16
第一章前言  16-35
  1 海洋及海洋微生物资源  16
  2 海洋真菌  16-18
    2.1 海洋真菌的定义  16-17
    2.2 海洋真菌的生物多样性  17-18
    2.3 海洋真菌的分布  18
  3 海洋污染的生物修复  18-19
    3.1 海洋污染现状  18
    3.2 海洋真菌的生物修复作用  18-19
  4 苯二甲酸酯类(Phthalate esters,PAEs)化合物简介及其危害  19-23
    4.1 苯二甲酸酯类化合物(PAEs)的工业应用  19
    4.2 苯二甲酸酯类化合物(PAEs)的理化性质  19-20
    4.3 苯二甲酸酯类化合物(PAEs)的危害  20-23
  5 苯二甲酸酯类化合物(PAEs)的生物降解  23-29
    5.1 苯二甲酸酯类化合物(PAEs)的细菌降解  23-28
      5.1.1 苯二甲酸酯类化合物(PAEs)的好氧细菌降解  23-27
      5.1.2 苯二甲酸酯类化合物(PAEs)的厌氧细菌降解  27-28
    5.2 苯二甲酸酯类化合物(PAEs)的真菌降解  28
    5.3 苯二甲酸酯类化合物(PAEs)降解相关的酯酶  28-29
  6 甲醛简述及甲醛降解  29-31
    6.1 甲醛简介  29
    6.2 甲醛的危害  29-30
    6.3 甲醛的生物降解  30-31
  7 本论文的研究内容和意义  31-33
  8 研究技术路线图  33-35
    8.1 海洋真菌Fusarium sp. DMT-5-3的间苯二甲酸二甲酯降解酯酶的分离纯化与酶学性质研究  33-34
    8.2 海洋真菌Penicillium chrysogenum DY-F2的甲醛降解特性研究  34-35
第二章海洋真菌Fusarium sp. DMT-5-3的间苯二甲酸二甲酯降解酯酶的分离纯化与酶学性质研究  35-68
  1 材料与方法  35-50
    1.1 实验材料  35-39
      1.1.1 菌株来源  35
      1.1.2 主要试剂及材料  35-36
      1.1.3 主要仪器  36-37
      1.1.4 试剂盒  37
      1.1.5 主要培养基  37
      1.1.6 主要溶液  37-39
    1.2 实验方法  39-50
      1.2.1 Fusarium sp. DMT-5-3酯酶的诱导与提取  39-40
      1.2.2 酯酶参数的测定  40-42
      1.2.3 Fusarium sp. DMT-5-3酯酶的分离纯化  42-45
      1.2.4 蛋白质分子量分析  45-47
      1.2.5 酯酶的酶学特性研究  47-48
      1.2.6 酯酶的底物特异性  48-50
  2 结果与讨论  50-67
    2.1 DMI诱导下Fusarium sp. DMT-5-3胞内酶活和胞外酶活的比较  50-52
      2.1.1 胞内酶活的测定  50-51
      2.1.2 胞外酶活的测定  51
      2.1.3 胞内酶活和胞外酶活的比较  51-52
    2.2 Fusarium sp. DMT-5-3胞内酯酶的分离纯化  52-55
      2.2.1 阴离子交换柱阶梯式洗脱  52-53
      2.2.2 阴离子交换柱线性梯度洗脱  53-54
      2.2.3 分子筛凝胶层析  54
      2.2.4 蛋白分离纯化效率  54-55
    2.3 Fusarium sp. DMT-5-3胞内酯酶的分子结构初步分析  55-59
      2.3.1 分子筛凝胶层析确定酯酶蛋白分子量  55-57
      2.3.2 SDS-PAGE确定酯酶蛋白亚基分子量  57-58
      2.3.3 Native-PAGE与酯酶蛋白活性染色  58-59
    2.4 酯酶的酶学特性  59-65
      2.4.1 温度对酯酶的影响  59-61
      2.4.2 pH对酯酶的影响  61-63
      2.4.3 金属离子及螯合剂对酯酶活力的影响  63-64
      2.4.4 酯酶的底物特异性  64-65
    2.5 讨论  65-67
  3 本章小结  67-68
第三章海洋真菌Penicillium chrysogenum DY-F2的甲醛降解特性研究  68-83
  1 材料与方法  68-76
    1.1 材料  68-70
      1.1.1 菌株来源  68
      1.1.2 主要培养基  68-69
      1.1.3 主要溶液  69-70
      1.1.4 引物  70
      1.1.5 分析软件  70
      1.1.6 主要仪器  70
    1.2 实验方法  70-76
      1.2.1 真菌菌株DY-F2的鉴定  70-71
      1.2.2 真菌菌株DY-F2的甲醛耐受性分析  71-72
      1.2.3 真菌菌株DY-F2在甲醛存在下的最适生长温度和pH  72
      1.2.4 真菌菌株DY-F2的甲醛降解研究  72-76
  2 结果与讨论  76-82
    2.1 真菌菌株DY-F2的鉴定  76-77
    2.2 Penicillium chrysogenum DY-F2的甲醛耐受性  77
    2.3 Penicillium chrysogenum DY-F2在甲醛存在下的最适生长温度和pH  77-79
    2.4 Penicillium chrysogenum DY-F2对甲醛的降解  79-80
    2.5 甲醛降解动力学  80-81
    2.6 讨论  81-82
  3 本章小结  82-83
第四章总结和展望  83-85
参考文献  85-95
附录  95-96
致谢  96

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