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甲醛降解菌筛选、关键酶基因克隆表达和固定化细胞降解特性的研究

作　者: 金晶
导　师: 钟卫鸿
学　校: 浙江工业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 甲醛降解 甲醛脱氢酶 丝氨酸羟甲基转移酶 固定化细胞 Methylobacterium sp. XJLW Pseudomonas putida xyz-zjut
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


甲醛作为一种原生毒素,对生物体有很强的毒害作用,是室内空气污染的主要污染物之一。如何有效的控制空气中的甲醛污染,已引起人们的高度关注。通过生物法降解甲醛将成为去除甲醛的有利手段。本文旨在筛选甲醛降解菌,对甲醛代谢的关键酶进行克隆分析,并对固定化细胞的降解条件进行研究,为构建高耐受高效率降解甲醛的工程菌和生物法去除室内甲醛污染的应用奠定基础。利用以甲醛为唯一碳源的基本培养基,分离得到了一株甲醛降解新菌株,经形态学观察、生理生化特性鉴定及16S rDNA的同源性分析,初步鉴定该菌株属于甲基杆菌属(Methylobacterium),命名为Methylobacterium sp. XJLW。该菌株在初始驯化阶段,甲醛耐受浓度为0.1g/L,且在液体培养基中生长缓慢。实验室已经分离得到的一株甲醛降解菌株Pseudomonas putida xyz-zjut,该菌株的甲醛最高耐受浓度为6g/L,降解效率高达0.114g/L·h。经比较,选取实验室已经分离的高活性高耐受甲醛菌株Pseudomonas putida xyz-zjut作为甲醛关键酶基因的研究对象。根据NCBI中公布的Pseudomonas putida基因序列,设计了两对特异性引物,克隆了甲醛同化作用关键酶—丝氨酸羟甲基酶(SHMT)和甲醛异化作用关键酶—甲醛脱氢酶(FDH)的基因。丝氨酸羟甲基酶基因大小为1254 bp,能编码417个氨基酸,甲醛脱氢酶基因全长1206 bp,编码401个氨基酸,与已报道的Pseudomonas putida F1及Pseudomonas putida KT2440具有较高的同源性。将甲醛脱氢酶基因连接至原核表达质粒pET-28b中,通过PCR,酶切鉴定及SDS-PAGE表明fdh基因成功克隆至载体pET-28b上,构建好的pET-28b-fdh在宿主E. coli BL21(DE3)成功获得了表达, SDS-PAGE中的目标蛋白质大小为43 kDa,与预期一致。但在检测工程菌降解甲醛的情况时发现甲醛降解效率没有明显的提高,推测原因可能是甲醛脱氢酶虽然表达了,但是大部分蛋白在宿主中是以包涵体形式存在,使得目的蛋白不具有甲醛脱氢酶活性。以海藻酸钙为包埋载体固定Pseudomonas putida xyz-zjut降解甲醛取得较好的效果。固定化细胞降解甲醛的海藻酸钙颗粒中的最适细胞密度为1.0×10~8 cells/mL,在温度30℃,培养基为MgSO4·7H2O 0.2 g/L,(NH4)2SO4 2.4 g/L,微量元素母液0.1 mL,pH值9的条件下,甲醛的降解效率高达0.107 g/L·h,高于国内外同类研究水平。该固定化细胞颗粒可应用于降解甲醛的反应器中,为生物法降解甲醛奠定基础。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第一章 文献综述  12-29
  1.1 室内甲醛污染的来源  12-14
  1.2 甲醛的污染治理方法  14-17
    1.2.1 通风换气式法  14
    1.2.2 控制温湿度法  14
    1.2.3 物理吸附法  14-15
    1.2.4 化学法  15-16
      1.2.4.1 化学反应法  15
      1.2.4.2 臭氧氧化法  15
      1.2.4.3 空气负离子技术  15-16
      1.2.4.4 光催化法  16
      1.2.4.5 常温催化氧化法  16
    1.2.5 生物法  16-17
      1.2.5.1 植物吸收法  16-17
      1.2.5.2 微生物降解法  17
  1.3 甲醛在微生物中的代谢途径  17-22
    1.3.1 甲醛代谢的同化途径  18-20
      1.3.1.1 丝氨酸循环  18-19
      1.3.1.2 核酮糖单磷酸途径（RuMP）途径  19-20
    1.3.2 甲醛代谢的异化途径  20-22
      1.3.2.1 谷胱甘肽（GSH）依赖型异化途径  20-21
      1.3.2.2 叶酸-依赖型异化途径  21-22
      1.3.2.3 甲醛环化氧化途径  22
  1.4 国内外研究现状  22-23
  1.5 本文研究的意义及内容  23-24
  参考文献  24-29
第二章 甲醛降解新菌株的分离纯化及鉴定  29-44
  2.1 引言  29-30
  2.2 材料  30-32
    2.2.1 甲醛降解菌样品的采集  30
    2.2.2 培养基及试剂  30-31
      2.2.2.1 培养基  30-31
      2.2.2.2 试剂  31
    2.2.3 药品与试剂  31-32
    2.2.4 仪器  32
  2.3 方法  32-37
    2.3.1 分光光度法测定甲醛浓度  32-33
    2.3.2 样品甲醛浓度的测定  33
    2.3.3 菌株的筛选及分离纯化  33
    2.3.4 菌株的鉴定  33-37
      2.3.4.1 革兰氏染色  33-34
      2.3.4.2 透射电镜观察  34
      2.3.4.3 生理生化特征  34-35
      2.3.4.4 分子生物学鉴定  35-37
  2.4 结果与分析  37-41
    2.4.1 菌株的筛选及分离纯化  37
    2.4.2 菌株的鉴定  37-41
      2.4.2.1 革兰氏染色  37-38
      2.4.2.2 透射电镜观察  38
      2.4.2.3 生理生化特征  38-39
      2.4.2.4 分子生物学鉴定  39-41
  2.5 小结  41
  参考文献  41-44
第三章 Pseudomonas putida xyz-zjut 甲醛降解关键酶基因的克隆和表达  44-66
  3.1 引言  44-45
  3.2 材料  45-48
    3.2.1 菌株和质粒  45
    3.2.2 主要试剂  45-46
    3.2.3 实验仪器  46-47
    3.2.4 PCR 引物  47
    3.2.5 主要培养基及试剂  47-48
  3.3 方法  48-53
    3.3.1 菌株xyz 菌基因组DNA 的提取  48-49
    3.3.2 PCR 扩增丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）和甲醛脱氢酶（FDH）的基因  49
    3.3.3 凝胶回收纯化DNA  49-50
    3.3.4 连接反应  50
    3.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备  50-51
    3.3.6 转化大肠杆菌感受态细胞  51
    3.3.7 试剂盒快速小量提取质粒DNA  51-52
    3.3.8 酶切反应  52
    3.3.9 蛋白电泳检测重组蛋白的表达  52-53
  3.4 结果与分析  53-64
    3.4.1 丝氨酸羟甲基转移酶的克隆  53-57
    3.4.2 甲醛脱氢酶的克隆与表达  57-64
      3.4.2.1 甲醛脱氢酶基因片段的获得  57-62
      3.4.2.2 pET28b-fdh 重组质粒的构建  62-63
      3.4.2.3 重组蛋白在E. coli BL21 中的蛋白表达分析  63-64
  3.5 小结  64-65
  参考文献  65-66
第四章 固定化Pseudomonas putida xyz-zjut 降解甲醛的研究  66-79
  4.1 引言  66-67
  4.2 材料  67-69
    4.2.1 实验菌种  67
    4.2.2 培养基及试剂  67
    4.2.3 药品与试剂  67-68
    4.2.4 仪器  68-69
  4.3 方法  69-71
    4.3.1 样品甲醛浓度的测定  69
    4.3.2 菌种的预培养及活化  69
    4.3.3 固定化颗粒的制备  69
    4.3.4 菌体固定化后的甲醛降解效果  69-70
    4.3.5 不同培养基对固定化颗粒降解甲醛的影响  70
      4.3.5.1 蛋白胨水培养基与生理盐水对固定化颗粒降解甲醛的效果比较  70
      4.3.5.2 无机盐培养基与生理盐水对固定化颗粒降解甲醛的效果比较  70
    4.3.6 固定化菌株在不同菌浓下的甲醛降解效果  70-71
    4.3.7 固定化菌株在不同温度下的甲醛降解效果  71
    4.3.8 固定化菌株在不同 pH 的甲醛降解效果  71
  4.4 结果与分析  71-77
    4.4.1 菌体固定化后对甲醛的降解效果  71-72
    4.4.2 不同培养基对固定化细胞降解甲醛的影响  72-74
      4.4.2.1 蛋白胨水培养基与生理盐水对固定化颗粒降解甲醛的效果比较  72-73
      4.4.2.2 无机盐培养基与生理盐水对固定化颗粒降解甲醛的效果比较  73-74
    4.4.3 固定化菌株在不同菌浓下的甲醛降解效果  74-75
    4.4.4 固定化菌株在不同温度下的甲醛降解效果  75-76
    4.4.5 固定化菌株在不同pH 下的甲醛降解效果  76-77
  4.5 小结  77
  参考文献  77-79
第五章 实验总结与展望  79-81
致谢  81-82
攻读学位期间发表的学术论文和专利目录  82

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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