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华丽腐霉EPA合成关键酶基因克隆及工程菌的构建

作　者: 张瑞姣
导　师: 余龙江
学　校: 华中科技大学
专　业: 微生物学
关键词: 腐霉二十碳五烯酸去饱和酶基因基因克隆与表达基因工程菌
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 7次
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内容摘要

EPA（Eicosapentaenoic acid）属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，具有降低血脂、预防心血管疾病、抗癌、抗炎等重要生理功能。EPA的开发应用已受到世界各国科学家的关注与重视，利用微生物发酵生产EPA是目前的研究热点。本文以产EPA的华丽腐霉RBB-5为研究对象，克隆了EPA合成途径关键酶基因，并进一步构建了基因工程菌，取得了如下结果：（1）克隆了华丽腐霉的Δ6去饱和酶基因和Δ17去饱和酶基因。序列比对结果表明，Δ6和Δ17去饱和酶基因序列与已报道基因序列同源性分别为86%和99%。推导的氨基酸序列中均存在3个组氨酸保守区HXXXH、HXXHH和Q/HXHH，Δ6去饱和酶的氨基酸序列中还存在一个细胞色素b5结构域，它们对基因功能的正常表达是必需的。实验中对两个去饱和酶的进化关系也进行了分析。另外，从高山被孢霉中克隆得到了Δ12去饱和酶基因。（2）将Δ6去饱和酶基因构建酵母表达载体pPIC3.5K-D6，并转入毕赤酵母进行基因功能验证。结果表明，Δ6去饱和酶在酵母中成功表达，表达产物催化LA转化为GLA，GLA含量占总脂肪酸含量的1.3%，但不能催化ALA合成STA。这表明，华丽腐霉的Δ6去饱和酶对底物LA具有偏好性。（3）将Δ12、Δ6和Δ17去饱和酶基因分别构建三个单价表达载体，通过农杆菌介导转化华丽腐霉，利用潮霉素筛选转化菌株，通过对抗性菌株进行GFP显微观察和PCR检测，结果表明，去饱和酶基因已经整合到了华丽腐霉的基因组中。转基因菌株的脂肪酸分析结果表明，去饱和酶基因拷贝数的增加促进了脂肪酸的转化，EPA含量得到了提高，最高提高了24.6%。实验中获得的转基因菌株为进一步分析基因表达量和EPA等脂肪酸合成关系及EPA高产工程菌构建奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-19
  1.1 EPA 生理功能及来源  9-11
  1.2 脂肪酸去饱和酶研究进展  11-14
  1.3 基因工程方法生产 PUFAs 的研究  14-16
  1.4 腐霉合成 EPA 研究进展  16-17
  1.5 本研究的目的意义及主要内容  17-19
2 EPA 合成关键酶基因的克隆与分析  19-44
  2.1 实验材料  19-20
  2.2 实验方法  20-30
  2.3 结果与分析  30-42
  2.4 讨论  42-43
  2.5 本章小结  43-44
3 华丽腐霉基因工程菌的构建  44-58
  3.1 实验材料  44
  3.2 实验方法  44-51
  3.3 结果与分析  51-56
  3.4 讨论  56-57
  3.5 本章小结  57-58
4 总结与展望  58-60
  4.1 全文总结  58-59
  4.2 展望  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-69
附录攻读学位期间发表论文  69

华丽腐霉EPA合成关键酶基因克隆及工程菌的构建

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