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不同葡萄CBF_1基因序列差异性分析及植物表达载体构建

作　者: 肖啸
导　师: 李唯；杨德龙；王旺田
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 发育生物学
关键词: 葡萄 CBF1基因 克隆 植物表达载体
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


植物在经受低温胁迫后会发生不同程度的伤害,严重时甚至导致整个植株死亡。近年来在模式植物拟南芥中发现的CBFs（CRT/DRE binding factors）低温反应途径,使当前果树抗寒分子生物学与基因工程研究取得了重大突破。CBFs（C-repeat binding factors）基因能够与COR基因启动子区域的CRT/DRE（C- repeat/dehydration responsive element）顺式作用元件识别并特异结合,诱导COR基因表达,从而提高植物的抗寒能力。CBFs基因能够综合改良植物的抗逆性状,已成为植物抗寒分子育种的研究热点。本研究对山葡萄、贝达、Ln33、SO4、黑比诺的低温诱导转录因子CBFl基因进行了克隆与序列差异性分析;构建了山葡萄转录因子CBFl基因的植物表达载体,为下一步建立葡萄高效遗传转化体系奠定实验基础。本实验主要研究结果如下:⑴根据欧洲葡萄CBF1基因序列设计1对特异引物,采用PCR方法从山葡萄、贝达、Ln33、SO4、黑比诺基因组中各扩增出1个DNA片段并克隆到pMD18-T载体中。经序列测定和分析,各片段均长756bp,与欧洲葡萄CBF1基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列分别具有98.28～99.21%和98.39～98.8%的同源性,而且推导的氨基酸序列中包含有同源性更高的AP2/EREBP DNA结合域以及CBFs蛋白的两段特征序列（PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR）。结果表明,从五种葡萄中均可以克隆出CBF1基因。⑵对五种葡萄CBFl蛋白进行一级结构分析,CBFl蛋白的分子式为C1191～1202H1899～1908N347～350O378～380S12,相对分子质量为27.57～27.69kD,理论等电点为6.97～8.41,脂肪系数平均为65.74～66.14,亲水性平均数为-0.576～-0.564,不稳定系数为48.34～52.22,均为不稳定蛋白;又对五种CBFl蛋白进行了亲/疏水性、信号肽、跨膜结构分析,均为亲水性、非分泌蛋白,无信号肽及跨膜结构域存在。结果表明,五种葡萄的CBF1基因无明显差异存在。⑶利用CaMV 35S启动子构建了山葡萄转录因子CBFl基因的植物表达载体。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pMD18-CBF1和pBI121两种质粒DNA,分别回收CBF1基因片段和除去了GUS基因的pBI121表达载体,将pBI121表达载体与CBF1基因连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,并对重组质粒进行PCR、BamHI和SacI双酶切鉴定。结果表明,成功构建了CBF1基因植物表达载体pBI-CBF1。

全文目录


摘要  2-3
Summary  3-5
缩略词表  5-10
第一章 文献综述  10-17
  1 引言  10
  2 植物抗寒分子机理研究进展  10-12
    2.1 抗冻蛋白基因  11
      2.1.1 昆虫抗冻蛋白基因  11
      2.1.2 植物抗冻蛋白基因  11
    2.2 与膜结构及其稳定性相关的基因  11
      2.2.1 甘油三磷脂酰转移酶  11
      2.2.2 脂肪酸去饱和酶  11
    2.3 与活性氧清除相关的基因  11-12
      2.3.1 超氧化物歧化酶  11
      2.3.2 过氧化氢酶  11-12
      2.3.3 抗坏血酸过氧化物酶  12
      2.3.4 谷胱甘肽还原酶  12
    2.4 胚胎发育晚期富集蛋白基因  12
  3 CBFS 转录因子研究进展  12-14
    3.1 CBFs 的鉴定  12
    3.2 CBFs 基因的结构与特性  12-13
    3.3 CBFs 基因的调控因子  13-14
      3.3.1 正调控因子  13
      3.3.2 负调控因子  13-14
    3.4 CBFs 基因调控的下游基因  14
    3.5 CBFs 基因调控的生理生化功能  14
    3.6 CBFs 基因在抗逆条件下的交叉适应现象  14
  4 植物基因工程常用启动子研究进展  14-16
    4.1 启动子的概念  14-15
    4.2 启动子的结构特征  15
      4.2.1 TATA 盒  15
      4.2.2 转录起始点  15
      4.2.3 CAAT 盒  15
      4.2.4 GC 盒  15
    4.3 启动子的类型  15-16
      4.3.1 组成型启动子  15
      4.3.2 诱导型启动子  15-16
      4.3.3 组织或器官特异型启动子  16
  5 本研究的目的和意义  16-17
第二章 不同葡萄CBF_1基因片段的克隆及序列分析  17-39
  1 技术路线  17-18
  2 材料与试剂  18-20
    2.1 植物材料  18
    2.2 载体及菌株  18
    2.3 实验药品  18
    2.4 实验仪器与设备  18
    2.5 主要试剂溶液及培养基的配制  18-20
  3 实验方法  20-26
    3.1 五种葡萄基因组DNA 的提取及浓度检测  20-22
      3.1.1 五种葡萄基因组DNA 的提取  20-21
      3.1.2 检测DNA 的质量与纯度  21-22
    3.2 目的片段的PCR 扩增  22
      3.2.1 引物设计与合成  22
      3.2.2 目的片段的PCR 扩增  22
    3.3 PCR 产物的回收  22-23
    3.4 目的片段与pMD18-T 载体连接  23
    3.5 E.coli DH5α感受态细胞的制备  23-24
    3.6 连接产物的转化  24
    3.7 重组质粒的鉴定  24-25
      3.7.1 蓝白斑筛选  24
      3.7.2 碱裂解法小量提取质粒DNA  24-25
      3.7.3 重组质粒PCR 鉴定  25
      3.7.4 重组质粒的双酶切鉴定  25
    3.8 序列测定及生物信息学分析  25-26
  4 结果与分析  26-36
    4.1 葡萄基因组DNA 质量分析  26
    4.2 CBF_1 基因的PCR 扩增  26-27
    4.3 CBF_1 基因阳性克隆鉴定  27-28
    4.4 CBF_1 基因序列的生物信息学分析  28-36
      4.4.1 CBF_1 基因的核苷酸序列分析  28-33
      4.4.2 CBF_1 基因的氨基酸序列分析  33
      4.4.3 CBF_1 一级结构及理化性质分析  33-34
      4.4.4 氨基酸序列疏水性/亲水性预测和分析  34-35
      4.4.5 氨基酸序列信号肽的预测和分析  35
      4.4.6 氨基酸序列跨膜结构域分析  35-36
  5 讨论  36-39
    5.1 葡萄基因组DNA 的提取  36-37
    5.2 PCR 引物的设计  37
    5.3 PCR 反应体系的优化  37-38
    5.4 测序  38-39
第三章 植物表达载体构建  39-48
  1 技术路线  39-40
  2 材料与试剂  40-41
    2.1 质粒与菌株  40
    2.2 实验药品  40
    2.3 实验仪器与设备  40
    2.4 主要试剂溶液及培养基的配制  40-41
  3 实验方法  41-44
    3.1 目的基因的制备  41-43
      3.1.1 摇菌  41-42
      3.1.2 质粒DNA 的提取  42
      3.1.3 CBF_1 片段的PCR 扩增  42
      3.1.4 目的片段的回收  42
      3.1.5 质粒pMD18-CBF_1 双酶切  42-43
    3.2 载体的制备  43
      3.2.1 摇菌  43
      3.2.2 质粒DNA 的提取  43
      3.2.3 质粒pBI121 双酶切  43
    3.3 目的基因与载体的连接  43
    3.4 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞  43
    3.5 重组质粒的鉴定  43-44
      3.5.1 重组质粒的PCR 鉴定  43
      3.5.2 重组质粒双酶切鉴定  43-44
  4 结果与分析  44-45
    4.1 目的基因和载体的准备  44
    4.2 重组质粒的鉴定  44-45
  5 讨论  45-48
    5.1 PCR 引物中引入酶切位点  45-46
    5.2 植物表达载体的选择  46
    5.3 DNA 连接酶的选择  46
    5.4 双酶切反应  46
    5.5 连接反应  46-48
第四章 结论  48-49
致谢  49-50
参考文献  50-57
导师简介  57-58
作者简介  58-60

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 浆果类 > 葡萄
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