学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒（HaSNPV）orf109性质的初步研究

作　者: 闫尧
导　师: 徐旭士
学　校: 南京师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒 orf109基因 原核表达 多抗制备 基因敲除
分类号: S476.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 15次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus, HaSNPV)是一类双链环状DNA病毒,其分子生物学和基因功能研究已取得很大进展。开放阅读框109 (open reading frame 109, orf 109)是HaSNPV的一个功能未知基因,本文首次对HaSNPV G4株基因组中的orf109进行研究报道。orf109基因及其编码蛋白HA109的序列经过生物信息学软件分析后显示：orf109全长357bp,编码118个氨基酸组成的肽链,预测蛋白质分子量大小为13.6kDa; orf109起始密码子上游-235位和-238位均存在早期启动子特征序列CAGT, TATAA,表明orf109可能是一个早期表达基因。Ha109是HaSNPV G4株特有的一个未知功能基因,由于其具有核输出信号,推测该基因很可能在宿主细胞核物质及能量运输,信号传递等方面起着特定作用：通过同源核酸及蛋白序列比对发现只与同种美洲棉铃虫HzSNPV orf112有99%以上同源性,仅具有几个核苷酸差异,但并不影响所编码的蛋白质的序列,因此核酸序列的差异反映了进化上的不同;orf109很可能是病毒在进化过程中不断重组和重排产生的新基因,但具体机理还不清楚。所以Ha109基因功能的研究对于阐明该基因的独特性及进化史具有重要意义。本试验中,我们利用表达载体pGEX-KG将orf109编码蛋白与谷胱甘肽S转移酶(GST)在表达宿主大肠杆菌BL21中融合表达,表达产物约为38.5KDa,与预期的大小相符。表达蛋白经初步纯化(包涵体纯化和凝胶电泳分离相结合),免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。经western-blot检测,获得了特异性较强的抗体,为进一步研究HA109蛋白的表达时相及其在病毒颗粒上的定位打下了基础。同时,我们也探索了GST-HA109融合蛋白的可溶性表达条件,我们发现融合蛋白主要以包涵体形式表达,在我们所尝试的任何条件下可溶性融合蛋白表达量都很低。为研究orf109的功能,我们通过同源重组在原核水平将该基因orf109敲除,构建orf109基因缺失型重组病毒。首先我们通过构建克隆的方法在pKS-egfp-Cmr质粒Phsp70-egfp-SV40-Cmr两端分别加上orf109的上下游同源臂,然后酶切回收带有同源臂的ha109UP-Phsp70-egfp-Cmr-ha109D0线性片段,借助编码λ噬菌体Red-ET线性重组酶系统的质粒pKD46及棉铃虫杆状病毒细菌人工染色体HaBacHz8,在大肠杆菌BW25113中进行同源重组。通过PCR及酶切鉴定,我们得到了orf109缺失型重组病毒HaBacΔ109。为系统分析orf109在病毒复制周期中的作用,我们利用Bac-to-Bac系统构建了带有绿色荧光蛋白egfp基因和多角体编码基因polyhedrin的四种基因型重组病毒：orf109缺失型重组病毒HaBacKO, orf109单回复型重组病毒HaBacSingleRep,orf109双回复型重组病毒HaBacDualRep,野生型对照重组病毒HaBacWt。四种基因型重组病毒的构建,为我们今后在细胞水平上研究orf109对病毒基因组的复制、出芽病毒滴度、包涵体病毒组装等方面的影响打下了重要基础。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-10
第1章 绪论  10-27
  1.1 杆状病毒简介  10-12
    1.1.1 杆状病毒的分类  10-11
    1.1.2 杆状病毒的形态结构  11
    1.1.3 杆状病毒的生活史  11-12
    1.1.4 杆状病毒的复制  12
  1.2 杆状病毒的分子生物学特性  12-16
    1.2.1 杆状病毒的基因组特征  12-13
    1.2.2 杆状病毒的结构蛋白基因  13
    1.2.3 杆状病毒的保守基因  13-15
    1.2.4 与DNA复制相关的基因  15
    1.2.5 与RNA转录及核苷酸代谢相关的基因  15
    1.2.6 杆状病毒的辅助基因(auxiliary gene)  15
    1.2.7 杆状病毒的进化  15-16
  1.3 杆状病毒功能基因组学研究方法概述  16-20
    1.3.1 基因的功能预测  16-17
    1.3.2 利用基因突变分析的方法研究杆状病毒基因的功能  17-18
    1.3.3 在杆状病毒分子生物学研究中一些高通量研究方法的可能的应用  18-20
  1.4 杆状病毒分子生物学研究的实践意义  20-21
    1.4.1 杆状病毒生物杀虫剂  20
    1.4.2 杆状病毒表达系统  20
    1.4.3 杆状病毒表面展示系统  20-21
    1.4.4 杆状病毒基因治疗载体  21
  1.5 本实验研究的背景及前期工作的总结  21-26
    1.5.1 棉铃虫病毒的早期研究  21
    1.5.2 棉铃虫病毒分子生物学研究阶段  21-22
    1.5.3 Orf109在棉铃虫病毒基因组中的位置及其序列特征  22
    1.5.4 Ha109的序列特征  22-23
    1.5.5 Orf109的功能结构域分析及其在细胞中的定位信息的预测  23-24
    1.5.6 Ha109蛋白二级结构的预测  24
    1.5.7 与其它杆状病毒同源蛋白的同源性比较分析  24-25
    1.5.8 系统树的构建  25-26
  1.6 本研究的目的及意义  26-27
第2章 棉铃虫核型多角体病毒(HaSNPV)G4株ORF109基因的克隆、原核表达及抗体制备  27-38
  引言  27
  2.1 材料  27-28
    2.1.1 菌株  27
    2.1.2 Bacmid  27
    2.1.3 质粒  27
    2.1.4 LB和LA培养基  27
    2.1.5 主要试剂及缓冲液  27-28
    2.1.6 主要设备及仪器  28
  2.2 方法  28-33
    2.2.1 大肠杆菌中杆粒的提取  28
    2.2.2 大肠杆菌电转化感受态细胞的制备  28-29
    2.2.3 电转化、涂布及培养  29
    2.2.4 引物的设计与合成  29
    2.2.5 HaSNPV orf109的扩增、克隆与测序  29
    2.2.6 大肠杆菌中质粒的提取  29-30
    2.2.7 HaSNPV orf109的亚克隆及阳性重组子的鉴定  30
    2.2.8 目的基因的诱导表达  30
    2.2.9 目的蛋白的SDS-PAGE  30-31
    2.2.10 HA109抗血清的制备  31
    2.2.11 抗血清效价测定  31-32
    2.2.12 Western-Blot  32-33
  2.3 结果分析  33-36
    2.3.1 Ha109的克隆及PKG-109的酶切鉴定  33-34
    2.3.2 重组表达载体pKG-109诱导表达和SDS-PAGE分析  34-35
    2.3.3 融合蛋白抗血清效价测定与Western-blot检测  35-36
  2.4 讨论  36-38
第3章 HaSNPV Ha109瞬时表达载体的构建  38-44
  引言  38
  3.1 材料  38-39
    3.1.1 质粒  38
    3.1.2 菌株  38
    3.1.3 引物  38
    3.1.4 低盐LB和LA培养基  38
    3.1.5 酶、化学试剂和试剂盒  38-39
    3.1.6 主要仪器  39
  3.2 方法  39-41
    3.2.1 pIZ/V5-egfp/orf109重组载体的构建  39
    3.2.2 pIZ/V5-egfp/orf109质粒的提取  39-41
  3.3 结果  41-42
    3.3.1 pIZ/V5-egfp重组质粒的鉴定  41
    3.3.2 pIZ/V5-egfp/orf109重组质粒的构建  41-42
  3.4 讨论  42-44
第4章 HaSNPV orf109缺失杆粒的构建  44-53
  引言  44
  4.1 材料  44-45
    4.1.1 实验用菌株  44
    4.1.2 Bacmid  44-45
    4.1.3 质粒  45
    4.1.4 LB和LA培养基  45
    4.1.5 主要试剂及缓冲液  45
    4.1.6 主要仪器及设备  45
  4.2 方法  45-49
    4.2.1 引物的设计与合成  45
    4.2.2 orf109基因上下游同源臂的扩增  45-46
    4.2.3 带有orf109同源臂的Phsp70-egfp-Cmr线性重组片段的获得  46
    4.2.4 BW25113(HaBacHZ8,pkd46)感受态细胞的制备  46-47
    4.2.5 HaBacHz8 orf109的敲除  47
    4.2.6 HaBacΔ109重组子的鉴定  47
    4.2.7 大肠杆菌DH10B(HaBacΔ109)菌株的构建  47-49
  4.3 结果与分析  49-50
    4.3.1 重组病毒HaBacΔ109的PCR鉴定  49-50
    4.3.2 重组病毒HaBacΔ109的酶切鉴定  50
  4.4 讨论  50-53
第5章 HaSNPV orf109基因敲除回复子的构建  53-67
  引言  53
  5.1 材料  53-54
    5.1.1 菌种  53
    5.1.2 杆粒  53
    5.1.3 质粒  53-54
  5.2 方法  54-61
    5.2.1 引物的设计与合成  54
    5.2.2 Polyhedrin多角体基因及ORF109基因的扩增  54
    5.2.3 质粒pFastBac-Dual-Polh的构建  54-55
    5.2.4 质粒pFastBac-Dual-ORF109的构建  55
    5.2.5 质粒pFastBac-Dual-Polh-ORF109的构建  55
    5.2.6 质粒pKS-Phsp70-egfp的构建  55-56
    5.2.7 质粒pFBD-Polh-Phsp70-egfp的构建  56
    5.2.8 转座用电转化感受态细胞的制备  56
    5.2.9 ORF109敲除回复子的建立  56-61
  5.3 结果与分析  61-65
    5.3.1 Polyhedrin及ORF109基因的PCR结果  61
    5.3.2 质粒pFastBacDual-Polh、pFastBacDual-ORF 109、pFastBacDual-Polh-ORF109的酶切鉴定结果  61-62
    5.3.3 ORF109敲除回复子的鉴定  62-65
  5.4 讨论  65-67
结论  67-68
参考文献  68-76
在读期间发表的学术论文及研究成果  76-77
致谢  77

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  5. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  6. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  7. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  8. 水稻黄单胞菌tal （transcription activator-like）基因功能研究,S435.11
  9. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  10. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  11. 人源β-防御素-6的原核表达及纯化,Q78
  12. 圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究,Q78
  13. 新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究,X172
  14. 产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的功能研究,TQ925
  15. 水稻黄单胞菌tal（transcription activator-like）基因功能研究,S435.111.4
  16. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  17. 载脂蛋白E基因敲除及高脂饮食小鼠海马神经元内IP3、IP3R-1和Aβ表达变化的研究,R329
  18. 兔源支气管败血波氏杆菌PRN蛋白的表达及其免疫保护性研究,S855.12
  19. 兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的克隆表达及快速检测方法的建立,S858.291
  20. murA基因对分枝杆菌生长相关性的研究,Q78
  21. 栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代苗期耐盐性与NHX1基因功能的初步研究,S565.1

中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用 > 昆虫病毒
© 2012 www.xueweilunwen.com