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脂肪干细胞向骨、软骨细胞诱导分化及新型椎间盘支架构建的实验研究

作　者: 许海委
导　师: 徐宝山
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: 组织工程骨软骨种子细胞椎间盘支架纤维环
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：1.探讨兔脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)向骨、软骨细胞定向分化的能力,为构建组织工程骨软骨提供理想的种子细胞；比较软骨细胞共培养法和诱导液培养法诱导ADSCs向软骨细胞分化的效果,为构建组织工程骨软骨提供更加有效的诱导方法。2.用脱细胞脱钙骨基质(cell-free deminerized bone matrix, CFDBM)和脱细胞髓核基质构建新型一体化纤维环-髓核双相支架,并进行理化检测,探讨其作为组织工程椎间盘支架的可行性；探讨不同脱细胞方法对猪尾椎间盘纤维环组织结构及生物力学特性的影响,为构建组织工程纤维环提供实验依据。方法：1.分离、培养兔ADSCs,将第3代ADSCs分别用成骨诱导液及软骨诱导液培养,显微镜观察细胞形态变化,14天后通过组织学观察和实时荧光定量PCR检测其分别向骨、软骨细胞定向分化的能力。2.分别用与软骨细胞共培养法和诱导液培养法诱导ADSCs向软骨细胞分化并鉴定,显微镜观察ADSCs的形态变化,14天后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化,实时荧光定量PCR测定软骨细胞相关基因的表达情况,比较两种方法的诱导效果。3.取猪股骨近端松质骨,塑形成外径10mm、内径5mm、厚3mm的骨环,经脱脂、脱钙、脱细胞处理制备成纤维环相支架部分；取猪尾髓核组织,脱细胞后粉碎离心,制备脱细胞髓核基质,注入纤维环相支架中央,冷冻干燥,交联,作为髓核相支架部分。通过大体观察、HE染色、扫描电镜观察纤维环-髓核双相支架的结构；测定支架的孔隙率、吸水率、压缩弹性模量；MTT法检测支架浸提液对ADSCs增殖的影响；Live/Dead染色观察细胞在支架上的活性。4.取新鲜猪尾纤维环,分别用三种脱细胞方法(分别含有Triton X-100、SDS、胰蛋白酶)对其进行脱细胞处理。大体观察脱细胞处理后的纤维环,采用组织学与扫描电镜观察脱细胞情况及超微结构的变化；测定脱细胞纤维环的胶原含量、GAG含量及力学参数。结果：1. ADSCs体外培养呈长梭形,增殖迅速,稳定性好。经过诱导逐渐变为成骨及软骨样细胞,14天后成骨诱导的ADSCs碱性磷酸酶染色、茜素红染色和von Kossa染色均为阳性；成软骨诱导的ADSCs甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化阳性,Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9的基因转录水平明显增高。2.两种方法培养的ADSCs逐渐变为软骨样细胞,甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性,其中诱导液培养法细胞染色更深,且Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9的基因转录水平明显高于软骨细胞共培养法。3.大体观察支架呈乳白色；HE染色显示无细胞残留；扫描电镜可见外层纤维环相支架孔径大小均匀一致,孔隙相互贯通,中央脱细胞髓核基质微丝连接成网,交界处结合紧密。纤维环相支架孔径为(343.00±88.25)μm,一体化支架孔隙率为82.98%±7.02%、吸水率为621.53%±53.31%,压缩弹性模量为(89.07±8.73)kPa。经MTT测定支架浸提液对细胞的增殖无影响；Live/Dead染色可见细胞在支架上生长良好。4.组织学及扫描电镜可见Triton X-100、SDS、胰蛋白酶三组均无细胞残留；Triton X-100组纤维环超微结构未见破坏,胰蛋白酶组轻度破坏,SDS组明显破坏。三组纤维环胶原含量与天然纤维环相比无统计学差异；但GAG含量均低于天然纤维环(P<0.05)。Triton X-100、胰蛋白酶两组的力学性能与天然纤维环相比无统计学差异,SDS组力学参数均低于天然纤维环(P<0.05)。结论：1.在特定条件下ADSCs可以向成骨细胞及软骨细胞定向分化；软骨细胞共培养法和诱导液培养法均可诱导ADSCs向软骨细胞定向分化,诱导液培养法诱导效果更好。2.用CFDBM和脱细胞髓核基质制备的一体化纤维环-髓核双相支架具有合适的孔径和孔隙率,无毒,力学性能与天然椎间盘接近,是构建组织工程椎间盘的理想支架载体。3. Triton X-100组处理后的猪尾椎间盘纤维环无细胞残留,结构无破坏,基质成分及力学性能保存良好,适合作为构建组织工程纤维环的支架材料。

脂肪干细胞向骨、软骨细胞诱导分化及新型椎间盘支架构建的实验研究

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