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目的建立兔退变椎间盘的动物模型,应用慢病毒载体介导Sox9基因体外转染兔MSCs,将其移植入椎间盘内,观察对兔退变椎间盘的影响。方法1.纤维环穿刺髓核抽吸法建立兔退变椎间盘模型取健康新西兰大白兔,术前排除脊柱畸形及退行性病变。麻醉后,取腹膜后外侧入路,暴露L3/4、L4/5、L5/6椎间盘,21G针头刺入椎间隙,深度控制在5mm,反复抽吸至吸出髓核。术前,术后定期行X线和MRI检查,观察椎间隙高度指数及髓核在T2像上的信号变化。12周后处死动物,取材行大体标本观察,并行病理学观察、免疫生化检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达情况。2.体外分离培养兔MSCs取2月龄新西兰大白兔,体重1.5～2.5 kg。麻醉后,无菌操作下抽取骨髓4～6ml(内含3000U/ml的肝素0.2m1),Percoll法分离骨髓单个核细胞,PBS洗涤细胞2次,以2×105/cm2的密度接种于40ml培养瓶。原代培养细胞接近70%～80%融合后,1:3比例进行传代培养,倒置显微镜观察细胞的形态和生长状态并拍照。取第3代MSCs,制成单细胞悬液,鉴定。3. Sox9慢病毒载体转染MSCs取第3代生长状态良好的MSCs,细胞达到70%～80%融合时,密度为5×105 /cm2,加入Sox9慢病毒载体,感染复数(muhiplicities of infection,MOI)为30,轻轻混匀,置于湿润的并含有5%CO2培养箱中37℃过夜培养,48小时后荧光显微镜观察绿色荧光的表达并计算转染率,Western-blot法检测Sox9蛋白的表达情况。4.移植Sox9基因修饰后的MSCs,观察其对兔退变椎间盘的治疗作用退变模型手术后,对照组损伤椎间盘不作任何处理;MSCs组损伤椎间盘移植入浓度为1×10~6/ml的MSCs,基因转染组注入Sox9基因修饰过的MSCs,每个椎间隙注入量为20μl。术后定期行X线及MRI检察,观察椎间隙高度指数和髓核T2像信号变化。12周后取材,通过免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。分光度法检测蛋白多糖的含量变化。结果1.实验组术后4周MRI观察到髓核信号降低,术后12周发现椎间隙高度和髓核信号明显降低,退变明显。免疫生化结果显示实验组Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量较对照组明显减少(P<0.05)。2.体外分离、培养和传代的兔MSCs具有增殖快,可重复性强等优点,是较理想的组织工程种子细胞之一。3. Sox9慢病毒载体转染MSCs后在倒置显微镜下细胞呈多角形,胞体增大,生长良好,胞内充满绿色荧光物质,转染率为90%以上。经MTT法和流式细胞仪检测发现转染对细胞的增殖以及细胞凋亡率无影响。Western-blot检测结果显示基因转染组Sox9蛋白表达明显高于空白对照组和空慢病毒载体转染组。4.术前,术后第4、8、12周行X线及MRI检查,对照组随着时间的推移椎间隙高度和髓核信号进行性降低;MSCs组椎间隙高度及髓核信号出现轻度降低;基因转染组椎间隙高度及髓核信号未见明显降低。免疫生化检测发现Ⅱ型胶原、蛋白多糖的含量在基因转染组最高,MSCs组次之,对照组最低。基因转染组疗效优于MSCs组(P<0.05)。结论1.纤维环后外侧穿刺髓核抽吸法可建立兔退变椎间盘模型。2.移植Sox9基因转染后的MSCs可以有效抑制兔椎间盘的退变,促进椎间盘的修复,疗效优于单纯移植MSCs。
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