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生物基质中RX31肽定量分析方法的建立、确证及其在药代动力学研究中的应用

作　者: 向慎思
导　师: 宋海峰
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 活性寡肽 RX31 液-质联用在线固相萃取药代动力学
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,它是两个以上氨基酸由肽键连接而成。一般将氨基酸残基少于10个的肽称为寡肽,50个以上的肽称为蛋白质,介乎二者之间者称为多肽。活性寡肽是指一类能调节各种生理活动与生化反应、具有多种生物活性的寡肽。目前在世界范围内,对于寡肽分子的研究和利用已呈现出空前繁荣景象。活性寡肽及其代谢产物的快速筛选、分析与鉴定,是将其作为药物研究,并推向临床应用的过程中至关重要的环节。特别是研究活性寡肽在复杂生物基质中“质”与“量”的变化,是阐明寡肽药物“安全性、有效性、可控性”的物质基础。因此,建立灵敏、准确、可靠、高效的寡肽体内、外分析方法在该类药物研发过程中起着关键作用。活性寡肽的组成及分子量的大小决定了该类化合物兼具小分子化合物与生物大分子二者的特点,继而决定了在生物基质中对其进行定量分析的复杂性与挑战性。如何有效去除复杂生物基质中与活性寡肽组成、分子量大小相似的海量干扰,并对其进行灵敏、准确而又高效地定量分析,成为药物分析与药代动力学研究中的热点与难点之一。随着生物质谱技术的发展,液相色谱-生物质谱联用（LC-MS）技术已越来越多地被应用于生物大分子的定性与定量分析。得益于此,复杂生物基质中寡肽药物的定量分析技术也有了跨越式的提升。但在样品制备、内标物选择以及色谱、质谱软、硬件条件优化等方面仍有待进一步提高。本论文所涉及的活性寡肽RX31（D-Arg-2’, 6’-Dmt-Lys-Phe-NH2）,是由精氨酸、二甲基酪氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸四个氨基酸所构成。前期研究结果表明,RX31肽能够靶向性保护线粒体,有效清除自由基,减轻辐射对细胞、组织以及整体的间接损伤,有望成为新型辐射防护药物。本研究旨在利用LC-MS/MS技术,建立复杂生物基质中RX31肽的定量分析方法,并应用于RX31肽的动物药代动力学研究。研究分为三个部分:（1）整合在线固相萃取（on-line SPE）样品前处理技术,系统优化色谱、质谱软、硬件条件,建立复杂生物基质（血浆）中RX31肽的定量分析方法。（2）针对不同种属生物基质,对所建立的on-line SPE LC-MS/MS定量分析RX31肽的方法进行系统的方法学确证。（3）将经过方法学确证的定量分析方法学应用于RX31肽的药代动力学研究,观察RX31肽在小鼠体内的药代动力学特点。第一部分复杂生物基质中RX31肽定量分析方法的建立自行搭建在线固相萃取液质联用（on-line SPE LC-MS/MS）的系统,并对生物基质中寡肽RX31肽进行了定量分析研究。分别优化了方法中液相上样、洗脱、分离等程序,质谱检测条件以及血浆样品的处理方法,最终确定了血浆样品采用乙腈沉淀,色谱分析柱为资生堂CAPCELL PAK MGⅢ柱（5μm,2.0 mm×50 mm）,在线固相萃取柱为Alltech公司不锈钢柱（2.1 mm×50 mm）,装填市售固相萃取填料（40μm - 60μm粒径,球形填料,Sunchrom公司）。分析柱采用梯度洗脱,流动相为MetOH - 0.1% FA（5 : 95,v : v）,流速为0.20 mL·min^-1;固相萃取柱流动相为MetOH - 0.1% FA,流速为1.00 mL·min^-1。检测方式为正离子多反应监测（MRM）,采用气动辅助电喷雾离子化（ESI）方式,检测对象为RX31肽。最终建立了在生物基质中寡肽RX31肽on-line SPE LC-MS/MS定量分析方法,也可以为相似性质寡肽的定量研究提供参考。第二部分定量分析方法学确证在不同动物种属生物基质中对on-line SPE LC-MS/MS的方法进行方法学确证。研究发现不同种属生物基质（血浆）存在种属差异。小鼠血浆方法学确证中,我们采用了m/z 640.0→m/z 303.3定量分析离子对,但在猕猴血浆中,由于基质效应差异,用m/z 640.0→m/z 303.3定量导致灵敏度降低。为减少基质效应对灵敏度的干扰,我们替代选择m/z 321.0→m/z 303.3作为定量分析离子对。稳定性研究结果表明,RX31肽在小鼠血浆中反复冻融后不稳定,而在猕猴血浆中却表现出室温或4℃放置后出现降解。因此样品最佳保存条件为制备后迅速-80℃动存,避免反复冻融,融解后尽快测定。在小鼠血浆中方法学确证结果表明,定量分析离子对选择m/z 640.0→m/z 303.3),方法学线性范围为10 500 ng·mL^-1,最低定量下限（LLOQ）为10ng·mL^-1,准确度（RE）-8.5 % 8.0 %,日内、日间精密度均小于8 %。在猕猴血浆中方法学确证结果表明,定量分析离子对选择m/z 321.0→m/z 303.3,方法学线性范围为10 500 ng·mL^-1,最低定量下限为10 ng·mL^-1,准确度为^-11.3 -5.2 %,日内、日间精密度均小于9%。在小鼠、猕猴血浆两种基质中RX31肽的定量分析方法均符合药代动力学研究的要求。第三部分RX31肽在小鼠体内的药代动力学研究中的应用将上述on-line SPE LC-MS/MS方法应用于RX31肽的非临床药代动力学研究中。观察了小鼠皮下注射不同剂量RX31肽后的血浆药物浓度-时间变化及药代动力学。结果表明,皮下注射10 mg·kg^-1,30 mg·kg^-1,90 mg·kg^-1后,达峰时间分别为10 min、20 min和10 min;峰浓度分别为4378±1484 ng·mL^-1、7404±4395 ng·mL^-1和35850±9024 ng·mL^-1;药时曲线下面积（AUC（0-∞））分别为140266.7 min·ng·mL^-1、455761.7 min·ng·mL^-1和2150774.0 min·ng·mL^-1,AUC（0-t）分别为:139906.1 min·ng·mL^-1、455240.2 min·ng·mL^-1和2150114.8 min·ng·mL^-1;末端相半衰期17.3 min、18.7 min和18.6 min;系统清除率分别为71.4 mL·min^-1·kg^-1、65.9 mL·min^-1·kg^-1和41.9 mL·min^-1·kg^-1。在研究涉及剂量范围(10 mg·kg^-1至90 mg·kg^-1)内,小鼠皮下注射RX31肽后药时曲线下面积和血药达峰浓度与剂量不呈线性相关,剂量之比为1 : 3 : 9,Cmax比为1 : 1.7 : 8.1,（AUC（0-∞）和AUC（0-t））之比均为1 : 3.3 : 15.4,高剂量给药后,Cmax与AUC（0-∞）和AUC（0-t）值呈现非线性增高,系统清除率显著降低,MRT有延长趋势,提示在给药剂量提高至90 mg·kg^-1时,RX31肽在小鼠体内呈现非线性动力学特征,此结果可为下一步临床用药研究奠定基础。本研究利用在线固相萃取技术与LC-MS/MS技术,建立了复杂生物基质中RX31肽定量分析方法,并对方法进行了系统的方法学确证。结果表明,所建立的on-line SPE LC-MS/MS定量分析方法具有灵敏、准确、可靠、高效的特点,完全能够满足RX31肽的非临床药代动力学研究要求。在RX31肽动物药代动力学实验中,利用自行装填的固相萃取柱完成了全部血浆样品的测定,样品在测定过程中无残留,仪器压力正常,未发生因血浆样品处理不净而发生堵塞色谱柱的现象,最终获取小鼠血药浓度-时间曲线及药代动力学结果。为RX31肽的药理学与毒理学结果提供了数据支持,为大动物药代动力学研究以及临床药代动力学研究提供了理论与实验依据。此外,方法学研究也为今后寡肽与多肽类药物的定量分析研究提供了参考。

生物基质中RX31肽定量分析方法的建立、确证及其在药代动力学研究中的应用

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