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磷脂酰乙醇胺结合蛋白参与阿片依赖的机制研究

作　者: 边佳明
导　师: 李锦
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 磷脂酰乙醇胺结合蛋白阿片依赖 μ阿片受体信号转导
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

物质依赖或称药物成瘾是一种慢性反复发作的脑疾病。在我国,阿片类物质占滥用物质的比例巨大,阿片依赖已经对我国人民健康和社会经济稳定造成严重危害。阿片依赖的生物学机制极其复杂,目前仍没有很好的办法对成瘾者进行有效的干预和治疗。阿片依赖是长期用药导致的一种神经系统病理性改变,如奖赏通路阈值的上调,动机形成系统异常,学习记忆过程改变等。阿片依赖涉及到不同脑区神经细胞内信号转导的代偿性适改变,如受体的脱敏,腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase, AC)活性的升高等。在阿片依赖形成的过程中,研究和发现这些代偿性变化的分子对于解释阿片依赖的神经生物学机制以及发现新的干预靶点和治疗措施具有极其重要的意义。磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP)是本课题组前期利用蛋白质组学研究技术在吗啡依赖大鼠模型中发现的在依赖相关脑区(海马最为明显)高表达的蛋白质分子。文献调研显示,PEBP具有多种功能,包括(1)PEBP结合Raf-1激酶,从而可能抑制ERK激活;(2)磷酸化的PEBP结合GRK2,从而可能抑制G蛋白偶联受体(GPCR)磷酸化;(3)PEBP可以促进Gi蛋白活性,从而可能改变GPCR活性;(4)PEBP是海马胆碱能刺激肽(HCNP)的前体,而HCNP具有刺激中隔核胆碱乙酰基转移酶(ChAT)合成的功能。这些功能中前三项与阿片受体信号通路调节密切相关,后一项与阿片依赖过程中神经功能调节密切相关。因此PEBP可能通过两方面机制参与阿片依赖的形成,一是通过影响阿片受体相关的信号转导;二是通过影响中枢胆碱能系统。除了我们的研究外,目前尚无PEBP参与调节阿片依赖的其他报道。本课题组的前期研究显示:高剂量吗啡慢性处理导致了海马脑区PEBP表达水平的上调,而用反义核酸下调海马内PEBP的表达水平则加重吗啡依赖的程度,提示PEBP的确参与了阿片依赖的病理过程。进一步的研究发现,PEBP的表达变化和海马ChAT活性变化高度相关,提示PEBP可能是通过调节海马胆碱能活性的机制参与了阿片依赖的形成。因此,本课题的研究目的是,在前期工作的基础上,进一步研究PEBP是否可以通过影响信号转导而参与阿片依赖。本课题的研究内容主要包括以下三部分:(1)在大鼠条件性位置偏爱(conditioned place preference, CPP)模型上研究依赖相关重点脑区(前额叶皮层,海马,伏隔核,纹状体)PEBP表达以及ERK活性的变化;(2)在细胞水平上研究μ阿片受体(μ-opioid receptor, MOR)介导的ERK激活与PEBP之间的关系;(3)在细胞水平上研究过表达PEBP对MOR功能的影响。具体结果如下:一、大鼠CPP模型中PEBP表达以及ERK活性的变化:在CPP效应的形成期、熄灭期及重建期,与盐水对照组相比,吗啡组大鼠前额叶皮层、海马、伏隔核和纹状体的PEBP表达水平均未出现显著变化。但在CPP效应形成期,吗啡组大鼠前额叶皮层的ERK活性显著升高,海马、伏隔核和纹状体的ERK活性不变;在CPP效应熄灭期,吗啡组大鼠上述四个脑区的ERK活性不变;而在CPP效应重建期,吗啡组大鼠海马的ERK活性显著降低,其他三个脑区ERK活性不变。这些结果提示,在成瘾的不同阶段ERK活性在各脑区的变化不完全相同,说明药物效应-环境关联性记忆的形成和唤起可能有不同的神经投射通路参与,但是PEBP并未参与到该过程中与关联性记忆相关的ERK活性调节。为了进一步阐明PEBP在MOR介导的ERK激活中的调节作用,我们在细胞水平上进行了第二部分研究。二、MOR介导的ERK激活与PEBP之间的关系:在高表达外源MOR的CHO细胞上或者内源性表达MOR的SH-SY5Y细胞上,MOR激动剂DAMGO或吗啡均可浓度依赖性及时间依赖性地激活ERK,但是不引起PEBP磷酸化水平的显著变化。吗啡慢性处理(10μM, 36h)上述细胞36h后,与对照比较,PEBP的表达量和磷酸化水平均无显著变化,ERK的活性也无显著变化;但是纳洛酮催促戒断后发现,ERK的活性显著下降,而PEBP的磷酸化水平仍无显著变化。在SH-SY5Y细胞上,用PKC激活剂PMA可以显著刺激ERK激活和PEBP磷酸化,但两者的时效曲线不同,PMA诱导的ERK磷酸化迅速升高到峰值,并可维持这一水平到1h以上;而PMA诱导的PEBP磷酸化则呈现缓慢升高的趋势,直到刺激1h时才表现为显著升高。PKC抑制剂G?-6983不能抑制DAMGO或吗啡诱导的ERK激活; AC激活剂Forskolin可以诱导ERK活性升高,但不影响PEBP磷酸化。这些结果提示,无论在急性还是慢性处理下,MOR介导的ERK活性调节与PEBP的磷酸化无相关性;cAMP/PKA通路的调节不影响PEBP磷酸化;PEBP确系PKC的底物,但是不参与调节PKC诱导的快速ERK激活。在此基础上,我们进一步研究了其他类型GPCR介导的ERK激活和PEBP磷酸化的关系。结果显示,在稳定表达多巴胺D1受体(偶联Gs)的HEK293细胞上,多巴胺仅能显著刺激ERK活性而不能调节PEBP的磷酸化;但在稳定表达肾上腺素α1A受体(偶联Gq)的HEK293细胞上,去甲肾上腺素不仅显著刺激ERK活性,也显著刺激PEBP磷酸化,其时效关系类似于PMA的作用,且G?-6983可完全抑制去甲肾上腺素诱导的ERK活性升高和PEBP磷酸化水平升高。这一结果表明,Gq偶联的肾上腺素α1A受体诱导的ERK和PEBP磷酸化水平升高依赖于PKC活性,其机制与该类型受体直接激活PKC有关。上述研究未发现MOR的激活可以调节PEBP,那么过表达PEBP是否会对MOR的功能产生影响呢?我们进行了第三部分研究。三、过表达PEBP对MOR功能的影响:首先在稳定表达MOR的CHO细胞的基础上,建立了稳定过表达PEBP的细胞克隆。研究表明,PEBP的过表达不影响细胞周期,不影响基础状态下ERK的活性,不影响MOR的表达量和亲和力,也不影响DAMGO对MOR的激动效应。这些结果提示PEBP过表达不影响细胞和MOR的基本状态和性质。进一步研究发现,DAMGO可以诱导MOR的快速脱敏和膜受体数量的下降,但MOR脱敏的程度和速度以及膜受体数量下降的程度和速度均不受PEBP过表达的影响。受体磷酸化是受体脱敏和内吞的前提,我们发现PEBP过表达也不影响MOR磷酸化,这可能是PEBP过表达不影响MOR脱敏和膜受体转运的原因。AC活性调节和与ERK通路的对话是MOR信号转导通路中的重要环节,进一步的研究发现,PEBP过表达导致胞内cAMP的基础水平显著降低,抑制了Forskolin诱导的cAMP水平的升高,抑制了DAMGO对Forskolin诱导的cAMP升高的抑制,抑制了DAMGO急性刺激诱导的ERK激活,但是不影响吗啡慢性处理后纳洛酮催促诱发的cAMP超射。这些结果提示,PEBP存在一种独立于GPCR的调节AC的能力; PEBP对Raf-1的干扰导致了DAMGO急性诱导的ERK磷酸化受到抑制;但是PEBP并未在吗啡诱导的AC活性代偿过程中发挥显著作用。综合以上三部分的实验结果,我们得出如下结论:(1)吗啡诱导CPP效应可以评价药物的奖赏效应与环境的关联性记忆,在CPP形成,熄灭,重建等三个阶段,PEBP在成瘾相关脑区(前额叶皮层,海马,伏隔核,纹状体)的表达不发生变化,而ERK活性在前额叶皮层和海马发生变化,表明阿片依赖过程中与成瘾记忆相关的ERK活性调节不通过PEBP介导;(2)在细胞水平上,MOR的急慢性激活均会调节ERK活性,但不能调节PEBP,表明MOR对ERK的活性调节也不通过PEBP介导;(3)在细胞水平,提高PEBP的表达量不影响MOR的表达量、亲和力,磷酸化、脱敏、以及吗啡慢性处理诱导的AC活性代偿;但是降低了细胞基础cAMP水平,抑制了DAMGO对cAMP的抑制和对ERK的激活,表明PEBP过表达在某些方面可以调节阿片受体的信号转导功能。综上所述,尽管PEBP具有调节ERK活性和GPCR功能的潜在能力,但是我们对整体动物和离体细胞研究后发现,PEBP并未显著参与阿片依赖过程中的一些重要环节,包括与关联性记忆中ERK活性的调节和MOR激活后的一些重要生化事件。过表达的PEBP在基础状态下抑制了胞内cAMP水平和Raf-1活性,并因此而导致DAMGO对cAMP的抑制和对ERK的激活受到影响,但从本文总的研究结果看,我们认为PEBP通过影响阿片受体相关的信号转导而参与阿片依赖机制的可能性较小,但其独立于受体抑制AC活性的机制有待进一步深入研究。

全文目录

缩略语表  5-9
摘要  9-13
ABSTRACT  13-17
前言  17-25
  药物成瘾及其可能机制  17-19
  PEBP 的功能和作用  19-22
  本课题组前期发现  22
  研究目的和意义  22-25
第一章大鼠条件性位置偏爱模型中PEBP 表达及ERK 活性的变化  25-37
  1 材料和方法  25-28
    1.1 实验动物  25
    1.2 主要试剂  25
    1.3 主要仪器  25-26
    1.4 实验方法  26-28
    1.5 统计分析  28
  2 结果  28-33
    2.1 吗啡诱导的大鼠CPP 效应的形成  28-30
    2.2 CPP 模型不同时期依赖相关脑区PEBP 表达分析  30-31
    2.3 CPP 模型不同时期依赖相关脑区ERK 活性分析  31-33
  3 讨论  33-37
第二章 MOR 介导的ERK 活性调节与PEBP 的关系  37-51
  1 材料和方法  37-38
    1.1 细胞  37
    1.2 主要试剂  37
    1.3 主要仪器  37
    1.4 实验方法  37-38
    1.5 统计分析  38
  2 结果  38-47
    2.1 急性激活CHO/μ细胞MOR 对ERK 和PEBP 磷酸化的影响  39-41
    2.2 急性激活SH-SY5Y 细胞MOR 对ERK 和PEBP 磷酸化的影响  41-42
    2.3 慢性吗啡处理对ERK 和PEBP 磷酸化的影响  42-43
    2.4 PEBP 磷酸化的调节方式  43-46
    2.5 其他类型GPCR 激活诱导的ERK 与PEBP 磷酸化  46-47
  3 讨论  47-51
第三章过表达PEBP 对MOR 功能的影响  51-71
  1 材料和方法  51-60
    1.1 质粒、克隆、菌株和细胞  51
    1.2 主要试剂  51
    1.3 主要仪器  51-52
    1.4 实验方法  52-60
    1.5 统计分析  60
  2 结果  60-68
    2.1 稳定表达HA-PEBP 载体的构建即细胞系建立  60-62
    2.2 PEBP 过表达对细胞周期和基础ERK 活性的影响  62-64
    2.3 PEBP 过表达对MOR 与G 蛋白偶联、MOR 磷酸化和脱敏的影响  64-66
    2.4 PEBP 过表达对MOR 信号转导的影响  66-68
  3 讨论  68-71
结论  71-73
参考文献  73-79
英文综述  79-119
  Reference  105-119
个人简历  119-121
致谢  121

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