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PEBP在切割穹窿海马伞大鼠海马中的表达变化

作　者: 李浩明
导　师: 金国华
学　校: 南通大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 磷脂酰乙醇胺结合蛋白切割穹窿海马伞海马实时聚合酶链反应原位杂交免疫印迹免疫组化大鼠
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的：探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内磷脂酰乙醇胺结合蛋白(Phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP)的表达差异。方法：(1) Real-time PCR:42只SD大鼠随机分成7组,每组6只。1组为正常对照组,其余6组分别为切割双侧穹窿海马伞后1、3、7、14、21和28 d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA并合成第一链cDNA,应用Real-time PCR的方法分析切割穹窿海马伞后大鼠海马内PEBP mRNA的表达变化。检测切割穹窿海马伞后各组及正常对照组PEBP和GAPDH基因表达的CT值,采用2-ΔΔCT法进行分析,所得的结果作为PEBP基因在不同时间点的相对表达量；(2)原位杂交：取6只SD大鼠,于切割右侧穹窿海马伞后第7d,灌注固定,制备海马部位冰冻切片,采用地高辛标记的PEBP RNA探针,在海马的前、中、后各取1张切片,进行原位杂交,观察两侧海马组织内PEBP mRNA的表达变化。分别对每张切片切割侧和正常侧锥体细胞层、齿状回颗粒层及门区、颗粒下层0.03mm2区域内的PEBP mRNA阳性细胞进行计数和平均灰度值检测；(3) Western Blot:42只SD大鼠随机分成7组,每组6只。1组为正常对照组,其余6组分为切割双侧穹窿海马伞后1、3、7、14、21和28 d组。取各组大鼠的海马组织,提取总蛋白并测定浓度,随后行SDS电泳并转膜,用兔抗PEBP抗体进行免疫印迹检测。对各时间点PEBP和β-actin阳性条带分别进行平均灰度值检测,二者比值的倒数作为PEBP蛋白不同时间点的相对表达量；(4)免疫组化：36只SD大鼠随机分成6组,每组6只。分为切割右侧穹窿海马伞后1、3、7、14、21和28d组。各组大鼠经心灌注固定后,取脑、冰冻切片,在海马的前、中、后各取1张切片行PEBP免疫组化染色,分别计数切割侧和正常侧大鼠海马锥体细胞层、齿状回颗粒细胞层及门区、颗粒下层0.06mm2区域内的PEBP阳性细胞的数目,并检测其灰度值；(5)用SPSS11.5统计学软件对各时间点数据进行方差分析和组间比较,对原位杂交和免疫组化切片数据进行配对t检验。结果：(1) Real-time PCR:海马内PEBP mRNA的相对表达量在正常组为1.16±0.10,在切割后第3d(1.51±0.08)开始升高,7d(1.64±0.07)达到最高水平,随后下降,21d(1.14±0.13)左右恢复至正常水平。各组PEBP mRNA相对表达量方差分析和两两比较结果表明,3d、7d组与其余各切割组之间存在显著性差异(P<0.05),3d、7d组之间及其余各组之间比较无显著性差异(P>0.05)；(2)原位杂交：切割侧和正常侧海马CA1～CA3锥体细胞层和齿状回颗粒层细胞均有PEBP mRNA表达,PEBP mRNA阳性细胞数无显著差异,但切割侧PEBP mRNA阳性细胞的平均灰度值为78.47±4.45,正常侧为102.58±15.99,切割侧杂交信号明显强于正常侧(P<0.01)。在切割侧齿状回门区和颗粒下层中观察到较多的PEBP mRNA阳性细胞(60.67±6.71),平均灰度值为67.16±9.28；而正常侧阳性细胞较少(50.33±8.52),平均灰度值为99.62±13.44,两侧阳性细胞数和平均灰度值比较有显著性差异(P<0.05);(3) Western Blot: PEBP蛋白的相对表达量正常对照组为0.0551±0.0093,在切割后第3d(0.077±0.0083)开始升高,7d(0.0965±0.0089)达到最高水平,随后下降,28d(0.0505±±0.0066)左右恢复至正常水平。各组PEBP相对表达量方差分析和两两比较结果表明,各切割组与正常组比较,1d、28d组与正常组间无显著性差异(P>0.05),其余各切割组与正常组间均存在显著性差异(P<0.05);各切割组间比较,切割后7d组与其余各组均存在显著性差异(P<0.05),3d、14d、21d与1d、28d间存在显著性差异(P<0.05),而3d、14d、21d间无显著性差异(P>0.05),1d、28d间也无显著性差异(P>0.05)；(4)免疫组化：PEBP免疫组化结果显示,PEBP主要表达于海马CA1～CA3区锥体细胞层、齿状回颗粒层及门区、颗粒下层的细胞胞浆中,各时间点切割侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层的PEBP阳性细胞数与正常侧相比无显著性差异(P>0.05),但切割侧PEBP阳性细胞染色加深,7d时最为明显,平均灰度值为68.41±10.53,而正常侧平均灰度值为91.52±7.77,两侧比较有显著性差异(P<0.01)。切割侧海马齿状回门区和颗粒下层中可见较多染色加深的PEBP阳性细胞,7d时最为明显,阳性细胞数为53.33±4.27,平均灰度值为65.34±15.84,而正常侧阳性细胞数为37.50±4.04,平均灰度值为97.16±11.62,切割侧细胞数及平均灰度值与正常侧相比均有显著性差异(P<0.05)。14d后锥体细胞层、齿状回颗粒层及门区、颗粒下层PEBP的表达开始下降,28d时接近正常侧。结论：(1)切割穹窿海马伞后海马组织中PEBP mRNA和蛋白的表达水平均明显上调,二者的表达水平均存在一个由低到高再到低的表达过程,且二者的升降趋势基本一致,切割后7d时达到最高峰；(2) PEBP mRNA和蛋白主要表达于海马CA1～CA3锥体细胞层、齿状回颗粒细胞层、门区及颗粒下层的细胞之中；(3)切割侧海马CA1～CA3锥体细胞层、齿状回颗粒细胞层与正常侧比较仅有染色加深；而齿状回门区及颗粒下层与正常侧相比,不仅染色加深,而且阳性细胞数增多。提示切割穹窿海马伞后海马中PEBP mRNA和蛋白的表达增高可能与海马中自体或植入的神经干细胞向神经元或胆碱能神经元的分化有关。

全文目录

英文缩略词表(Abbreviation)  6-8
中文摘要(Abstract in Chinese)  8-11
英文摘要(Abstract in English)  11-15
前言(Introduction)  15-18
实验一  18-26
  材料和方法(Material and Method)  18-22
  结果(Results)  22-26
实验二  26-32
  材料和方法(Material and Method)  26-29
  结果(Results)  29-32
实验三  32-44
  材料和方法(Material and Method)  32-39
  结果(Results)  39-44
讨论(Discussion)  44-48
结论(Conclusion)  48-49
参考文献(References)  49-51
综述(Review)  51-71
综述参考文献(References)  71-77
致谢(Acknowledgements)  77-78
已发表文章(Published Articles)  78

PEBP在切割穹窿海马伞大鼠海马中的表达变化

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