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舒芬太尼预处理对WIRS大鼠急性胃粘膜病变的保护作用及其与TRPV1、ASIC关系的研究

作　者: 蒋群
导　师: 屠伟峰
学　校: 南方医科大学
专　业: 麻醉学
关键词: 舒芬太尼 急性胃粘膜病变 μ-阿片受体 辣椒素受体 酸敏感离子通道 降钙基因相关肽 阿米洛利
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


背景急性胃黏膜病变(acute gasgtric mucosal lesion, AGML)又称应激性胃溃疡(stress ulcer, SU),是临床上发病率高、后果严重的一种常见急腹症,是多因素影响下胃黏膜保护因子与侵袭因子失衡的一种病理生理过程。包括休克和脓毒症在内各种病理条件下内脏血流灌注不足均可导致胃肠道酸中毒,胃肠道胞外pH值的下降已成为许多病理生理过程的标志,适当的酸感受,对维持胃肠道内环境的稳定起重要作用；而不合适的酸感受则可能促成了炎症和粘膜溃疡的发生。舒芬太尼(sufentail)是临床麻醉中常用的一种以μ-阿片受体激动为主的麻醉镇痛药,它能迅速通过血脑屏障在中枢和外周与阿片受体结合来发挥镇痛效应。我们已研究证明外周应用舒芬太尼对急性胃粘膜病变有明显的保护作用,其具体机制需得到进一步研究。瞬时受体电位离子通道(Transient receptor potential vanilloid-1, TRPV1),又称辣椒素受体和酸敏感离子通道(acid-sensitive ion channel-3,ASIC3)同为酸敏感离子通道,在胃投射DRG神经元中共存表达,已研究表明TRPV1/ASIC3在维持胃肠道内环境稳定中起重要作用,其中TRPV1的“传出样”作用是胃粘膜内源性保护作用的主要机制之一。研究表明TRPV1/ASIC3是在感受伤害疼痛神经元中表达的的选择性离子通道,在炎性超敏反应中表达上调,外周应用μ-阿片受体激动剂对炎症超敏反应非常有效,故推测两受体功能相联系,经炎症动物模型离体DRG细胞研究,外周应用吗啡可抑制TRPV1的电流,与TRPV1在胃粘膜中的保护作用不一致,故本研究通过复制急性胃粘膜病变模型,采用舒芬太尼预处理的方法研究激活μ-阿片受体对急性胃粘膜病变中的保护作用与TRPV1的关系。又ASIC3与TRPV1在DRG中共存表达,猜测μ-阿片受体与ASIC3功能上存在联系性。故本研究通过免疫荧光和激光扫描共聚焦方法旨在获得TRPV1/ASIC3和μ-阿片受体在DRG中的共存并相互作用的可靠证据,并采用实时定量RT-PCR和Western-Blot的方法研究TRPV1/ASIC3在急性胃粘膜病变大鼠胃投射DRG中的表达变化从而明确两受体在其发生机制中的作用,进一步研究舒芬太尼预处理即激活μ-阿片受体对DRG中TRPV1/ASIC3的表达的影响,并检测胃粘膜CGRP水平的变化,研究激活μ-阿片受体对TRPV1/ASIC3功能的影响。目的获得μ-阿片受体可以调控TRPV1/ASIC3的功能的可靠证据,阐述TRPV1/ASIC3在急性胃粘膜病变中发生机制中的作用,明确μ-阿片受体调控TRPV1/ASIC3的表达和功能的具体机制。方法研究过程分为四部分进行。(1)μ-阿片受体与TRPV1在胃调控脊髓背根神经节中共存表达。取成年雄性Wistar大鼠12只,分为正常组和应激模型组,采用免疫荧光共表达技术及激光共聚焦扫描技术观察大鼠胸段胃投射DRG神经元中μ-阿片受体和TRPV1共存表达。(2)舒芬太尼预处理对急性胃粘膜病变的保护作用与TRPV1的关系。取成年雄性Wistar大鼠36只,随机分为三组,正常组(NC组)、WIRS对照组(WS组)和舒芬太尼预处理组(SF组)。WIRS模型复制参照以往研究方法,舒芬太尼预处理在WIRS制模前2min腹腔注射舒芬太尼25μg／kg。①各组大鼠留取DRG标本,提取RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法,观察各组大鼠胃投射DRG中TRPV1mRNA表达变化；②提取各组大鼠DRG膜蛋白,采用Western-Blot的方法,观察研究胃投射DRG中TRPV1蛋白表达的变化；③取各组大鼠胃粘膜组织,在显微镜下观察胃粘膜UI计数,观察舒芬太尼预处理对急性胃粘膜病变的保护作用,并采用ELASA方法测定各组大鼠胃粘膜中CGRP水平的变化。(3)酸敏感离子通道阻断剂对急性胃粘膜病变的保护作用。采用成年雄性wistar大鼠30只,随机分为三组,每组10只,正常对照组(NC组)、WIRS对照组(WS组)和Amiloride预处理组(AM组)。WIRS模型复制同前述方法同前。AM组在WIRS制模前20min腹腔注射Amiloride(5μg/kg)。采用HE染色法观察Amiloride预处理对WIRS大鼠胃粘膜组织形态的影响,及大鼠胃粘膜中UI、SOD、MDA水平的影响。(4)舒芬太尼预处理对急性胃粘膜病变大鼠的保护作用与酸敏感离子通道的关系。采用成年雄性wistar大鼠24只,正常组(NC组,n=6)、WIRS对照组(WS组,n=12)和舒芬太尼预处理组(SF组,n=6)。WIRS模型复制参照以往研究方法,利用免疫荧光计数观察大鼠胃投射DRG中ASIC3的表达,并提取DRG中RNA,利用RT-PCR方法研究各组大鼠胃投射DRG中ASIC3mRNA的表达变化。结果(1)μ-阿片受体与TRPV1在胃调控脊髓背根神经节中共存表达。研究证明TRPV1和μ-阿片受体在胃投射DRG中共存表达,且急性胃粘膜病变大鼠中DRG中TRPV1和μ-阿片受体和正常组比较表达增多。(2)舒芬太尼预处理对急性胃粘膜病变的保护作用与TRPV1的关系。采用束缚浸水应激模型并采用舒芬太尼预处理得到如下结果：①正常组大鼠胃腔有淡黄色透明液体,胃黏膜呈淡红色,光滑完整,无充血。模型组组大鼠WIRS 6h后胃腔内见大量血性积液,大量暗红色血痂,胃粘膜,明显充血、水肿,呈深红色,损伤严重,呈点、线状甚至片状糜烂坏死。舒芬太尼预处理组大鼠胃腔液体呈淡黄色,黏膜出血或糜烂程度较模型对照组显著好转,胃粘膜仍存在充血水肿及出血坏死,但程度较轻,颜色较淡。计算溃疡指数结果发现,WS组胃粘膜溃疡指数显著增高(F=303.348,P=0.000),舒芬太尼预处理组大鼠溃疡指数较应激组显著降低(F=303.348,P=0.000)。②荧光实时定量PCR检测结果所示,大鼠胃投射DRG中的TRPV1mRNA相对表达量水平差别不显著(F=0.352,P=0.708)。③Western-Blot检测结果为大鼠胃投射DRG中TRPV1蛋白表达量,可见应激模型组大鼠DRG中的TRPV1蛋白水平显著高于正常组(F=315.168,P=0.000),而舒芬太尼预处理组大鼠DRG中的TRPV1蛋白水平显著高于应激模型对照组(F=315.168,P=0.000)。④实验得出各组大鼠胃粘膜组织内CGRP含量如所示,应激模型对照组的大鼠胃粘膜CGRP含量比正常组显著增高(F=33.142,P=0.006),而舒芬太尼预处理组的大鼠胃粘膜CGRP含量比应激对照组显著增高(F=33.142,P=0.000)。(3)酸敏感离子通道阻断剂对急性胃粘膜病变的保护作用。WIRS 6h后大鼠胃粘膜UI显著增高,,大鼠胃组织SOD水平显著降低(F=36.395,P=0.000),而胃粘膜MDA含量显著升高(F=29.469,P=0.000)；Amiloride预处理可使WIRS大鼠UI显著下降(F=132.299,P=0.000),提高急性胃粘膜病变大鼠胃组织SOD的活性(F=36.395,P=0.000)并抑制其胃粘膜MDA含量的增多(F=29.469,P=0.000)。(4)舒芬太尼预处理对急性胃粘膜病变大鼠的保护作用与酸敏感离子通道的关系。研究发现大鼠胃投射DRG神经元上表达ASIC3,主要定位于胞膜,荧光实时定量RT-PCR检测结果为大鼠胃投射DRG的ASIC3mRNA相对表达量,可见应激模型组大鼠DRG中的ASIC3mRNA水平显著高于正常组(F=26.295,P=0.004),而舒芬太尼预处理组大鼠DRG中的ASIC3mRNA水平显著低于应激模型组(F=26.295,P=0.023)。结论①TRPV1和¨-阿片受体在急性胃粘膜病变的发病机制中起作用,且两者功能上存在联系性。②舒芬太尼预处理对急性胃粘膜病变的保护作用机制和TRPV1有关,激活μ-阿片受体可增加TRPV1的表达,且刺激TRPV1释放CGRP而发挥胃粘膜保护作用。③酸敏感离子通道在急性胃粘膜病变发病机制中起作用,阻断ASIC3可减轻胃粘膜的损伤。④舒芬太尼对急性胃粘膜病变的保护作用机制和抑制ASIC3的表达有关。

全文目录


摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-16
第一部分 μ-阿片受体与TRPV1在胃调控脊髓背根神经节中共存表达  16-21
  1 材料与方法  16
  2 实验设计  16
  3 试验方法与步骤  16-17
  4 免疫荧光  17-18
  5 结果  18-21
第二部分 舒芬太尼预处理对急性胃粘膜病变的保护作用与TRPV1的关系  21-37
  1 材料和方法  21-22
  2 实验方法和步骤  22-28
  3 数据统计学处理  28
  4 结果  28-34
  5 讨论  34-37
第三部分 酸敏感离子通道阻断剂对急性胃粘膜病变的保护作用  37-45
  1 材料和方法  37
  2 实验方法和步骤  37-40
  3 统计学处理  40
  4 结果  40-43
  5 讨论  43-45
第四部分 舒芬太尼预处理对急性胃粘膜病变大鼠的保护作用与酸敏感离子通道的关系  45-51
  1 材料和方法  45
  2 标本采集和观察  45-47
  3 统计分析  47
  4 结果  47-49
  5 讨论  49-51
结论  51-52
参考文献  52-55
文献综述  55-63
中英文缩写对照表  63-64
在读期间完成论文情况  64-65
致谢  65-67
统计学证明  67

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 实验药理学
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