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生物法合成辛伐他汀

作　者: 朱丽平
导　师: 任宇红
学　校: 华东理工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 辛伐他汀酰基转移酶LovD 发酵条件生物催化条件
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

辛伐他汀是一种重要的降血脂药物,可经洛伐他汀合成。辛伐他汀能够显著降低心血管疾病或冠心病的发病率和死亡率,其毒副作用小,药物耐受性好,是降低体内胆固醇的首选药物之一。传统的生产工艺以洛伐他汀为原料,经化学法合成得到辛伐他汀；随着现代生物学的发展,辛伐他汀的生物合成受到越来越多的重视。本研究中,通过诱导E.coli工程菌种合成酰基转移酶LovD,催化DMB-S-MMP (alpha-dimethylbutyryl-S-methyl-merca-ptopropionate)及洛伐他汀水解产物Monacolin J进行转酰基作用,从而经一步生物催化合成得到辛伐他汀。通过对E.coli工程菌种发酵培养基和发酵条件进行优化,确定该菌株的适宜产酶条件为：接种量为4%,诱导起始菌浓为0.7(OD 600),IPTG浓度为0.2 mmol/L,在20℃下诱导20h。经优化后,酰基转移酶LovD的表达水平为100mg/L；酶活为263U/L,同优化前使用LB培养基相比,提高了将近5倍。在此基础上,对经发酵所得粗酶液的生物催化条件进行优化,确定最佳催化条件为：用pH为9.0的HEPES缓冲液重悬发酵所得菌体,在超声破碎并离心后得到粗酶液中加入底物Monacolin J和DMB-S-MMP,其终浓度分别为3 mmol/L和6 mmol/L; 25℃,200 r/min催化反应24 h。所得辛伐他汀浓度为1.3 g/L,产率为90.1%。本文从生物学角度出发,由洛伐他汀水解得到Monaconlin J,再利用LovD催化转酰基反应便可以得到辛伐他汀,有利于辛伐他汀的生物合成研究。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章综述与导言  11-24
  1.1 概述  11
  1.2 降血脂药物研究概况  11-12
    1.2.1 他汀类  11-12
    1.2.2 烟酸类  12
    1.2.3 胆固醇吸收抑制剂  12
  1.3 辛伐他汀产品简介与市场销售情况  12-13
    1.3.1 辛伐他汀产品简介  12-13
    1.3.2 辛伐他汀的市场销售情  13
  1.4 辛伐他汀药理概述  13-15
    1.4.1 药代动力学  13
    1.4.2 药理作用  13-15
    1.4.3 临床应用  15
  1.5 辛伐他汀的合成概述  15-18
    1.5.1 间接甲基化法  15-17
    1.5.2 直接甲基化法  17
    1.5.3 Monacolin J与侧链2,2-二甲基丁酰氯合成法  17-18
  1.6 微生物转化的研究进展  18-23
    1.6.1 概述  18
    1.6.2 微生物转化反应的特点  18-19
    1.6.3 微生物转化反应的影响因素  19
    1.6.4 微生物转化的主要方法  19-20
    1.6.5 他汀类药物的微生物转化  20-23
  1.7 本课题的研究背景与意义  23-24
第二章材料与方法  24-32
  2.1 实验材料  24-28
    2.1.1 菌种  24
    2.1.2 培养基  24-25
    2.1.3 常用试剂及耗材  25-27
    2.1.4 常用仪器与设备  27-28
  2.2 主要试剂的配制方法  28-29
  2.3 常用实验方法  29-32
第三章 Monacolin J和DMB-S-MMP合成  32-36
  3.1 引言  32
  3.2 实验材料与仪器  32
  3.3 实验方法  32-34
    3.3.1 Monacolin J钠盐的制备  32-33
    3.3.2 DMB-S-MMP的制备  33-34
    3.3.3 Monacolin J和DMB-S-MMP的结构确认  34
  3.4 结果与讨论  34-35
    3.4.1 Monacolin J钠盐的制备  34-35
    3.4.2 DMB-S-MMP的制备  35
  3.5 小结  35-36
第四章酰基转移酶LovD的发酵条件优化  36-48
  4.1 引言  36
  4.2 实验材料与仪器  36-38
  4.3 实验方法  38-41
    4.3.1 种子液的制备  38
    4.3.2 辛伐他汀钠盐溶液的制备  38
    4.3.3 酰基转移酶LovD发酵条件的优化  38-39
    4.3.4 粗酶液的制备  39
    4.3.5 酰基转移酶LovD表达检测和含量测定  39-40
    4.3.6 酰基转移酶LovD酶活测定方法  40-41
  4.4 结果与讨论  41-47
    4.4.1 酰基转移酶LovD表达  41-42
    4.4.2 酰基转移酶LovD发酵条件的优化  42-47
      4.4.2.1 发酵培养基的确定  42-43
      4.4.2.2 诱导温度的确定  43
      4.4.2.3 接种量的确定  43-44
      4.4.2.4 装液量的确定  44-45
      4.4.2.5 诱导起始菌浓的确定  45-46
      4.4.2.6 IPTG浓度的确定  46-47
      4.4.2.7 诱导总时间的确定  47
  4.3 小结  47-48
第五章辛伐他汀的生物转化条件优化  48-59
  5.1 引言  48
  5.2 实验材料与仪器  48
  5.3 实验方法  48-51
    5.3.1 种子液的制备  48
    5.3.2 摇瓶发酵培养  48
    5.3.3 粗酶液的制备  48
    5.3.4 辛伐他汀钠盐溶液的制备  48-49
    5.3.5 静息细胞的制备  49
    5.3.6 辛伐他汀含量测定与产率计算  49
    5.3.7 辛伐他汀的生物转化条件优化  49-51
  5.4 结果与讨论  51-58
    5.4.1 辛伐他汀标准曲线的绘制  51
    5.4.2 辛伐他汀生物转化条件优化  51-58
      5.4.2.1 辛伐他汀的生长转化、静息细胞转化和粗酶液转化  51-52
      5.4.2.2 底物Monacolin J浓度对辛伐他汀产率和产量的影响  52-53
      5.4.2.3 温度对辛伐他汀产率的影响  53
      5.4.2.4 pH对辛伐他汀产率的影响  53-54
      5.4.2.5 缓冲液种类对辛伐他汀产率的影响  54-55
      5.4.2.6 DMSO对辛伐他汀产率的影响  55-56
      5.4.2.7 转化时间对辛伐他汀产率的影响  56-58
  5.5 小结  58-59
第六章结论与展望  59-61
  6.1 结论  59
  6.2 展望及存在问题  59-61
参考文献  61-66
致谢  66

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