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丝氨酸激酶TBK1与雌激素受体α相互作用及其调控转录活性的研究

作　者: 魏从文
导　师: 马清钧; 钟辉
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: TBK1丝氨酸激酶雌激素受体α 蛋白质相互作用丝氨酸磷酸化
分类号: R730.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

雌激素受体(estrogen receptors)包括雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ),它们都属于核受体超家族成员。雌激素受体能够激活含有雌激素应答元件ERE基因的转录,从而引起细胞的恶性转化。ERα在乳腺癌的发生发展过程中起到了关键的作用,此外它还参与细胞生长、细胞分化、细胞形态发生以及细胞凋亡等重要的细胞生理活动。ERα可以与多种蛋白质发生相互作用,从而调节ERα的转录活性,这些能够与ERα结合,并调控其转录活性的蛋白质被称为ERα的共调节因子,这些调节因子根据功能划分为共激活因子和共抑制因子。ERα的结构由ABCDEF六个部分组成,其中包括两个转录激活结构域,即不依赖雌激素的AF1结构域和依赖于雌激素的AF2结构域,除此之外还包含DNA结合结构域和铰链区。ERα是核受体的一种,可以被多种蛋白质磷酸化修饰,从而调节其活性。目前已鉴定出人ERα有6个磷酸化位点,分别是第104位、106位、118位、167位、236位的丝氨酸以及第537位的酪氨酸。ERα的磷酸化修饰对其转录活性的影响机制有所不同,例如,第118位丝氨酸的突变降低了ERα的转录活性,而第537位苏氨酸的突变则增强了ERα与其DNA结合及二聚化的能力,进而激活其转录活性。因此探索调节ERα磷酸化的因子有助于我们对ERα信号通路的深入研究,从而更好的了解乳腺癌发生发展的分子机理。丝氨酸激酶TBK1(TANK binding kinase-1)是先天性免疫途径中的重要分子,它属于IKK激酶家族成员,具有丝氨酸磷酸化活性。近期研究表明TBK1在一些乳腺癌细胞系及肺癌中组成性的激活。TBK1在肺癌中的研究已经取得了一定的进展,但是其参与乳腺癌发生的机制尚不明确,我们的研究发现:1、TBK1可以与ERα发生相互作用:我们通过免疫沉淀、免疫印迹等实验证明了ERα与TBK1形成复合物;我们通过截短突变等方法进一步确定TBK1是通过其激酶结构域以及292-510结构域与ERα的DBD结构域相互结合。2、TBK1可以磷酸化ERα:通过激酶分析实验,发现ERα可以被TBK1磷酸化,但是不能被TBK1的激酶活性缺失突变体TBK1(K38A)磷酸化;通过点突变方法我们进一步确定了的第305、309、468以及578位点的丝氨酸是ERα可能的磷酸化位点,其中第468、578丝氨酸位点,尚未见有报道,是新的ERα磷酸化位点;通过进一步研究表明具有激酶活性的TBK1可以增强ERα和转录因子ERE的结合,但不能够增强ERα的稳定性。3、TBK1可以增强ERα的转录活性:通过荧光素酶报告基因实验发现TBK1可以通过雌激素依赖和雌激素非依赖两种方式增强ERα的转录活性;TBK1的激酶活性缺失突变体TBK1(K38A)则不能够增强ERα的转录活性;我们进一步观察了ERα磷酸化位点突变体对其转录活性的影响,ERα的第305、309、468以及578位丝氨酸突变后,基础转录活性不发生改变,而TBK1对ERα转录活性的增强作用丧失,这说明了TBK1增强ERα转录激活活性是由于TBK1使ERα发生磷酸化而导致的。已知TBK1的ULD结构域突变之后丧失了激活β干扰素的转录活性的能力,但是这种TBK1的突变依然可以增强ERα的转录活性,说明TBK1参与ERα信号传导途径的功能并不依赖于其参与先天性免疫应答的功能。4、TBK1可以促进乳腺癌细胞的生长和迁移:利用特异性的siRNA将TBK1基因沉默得到TBK1 RNAi稳定细胞株,通过细胞生长实验发现,TBK1敲低之后细胞生长的速度明显减缓,TBK1野生型回复突变之后能够恢复细胞正常生长速度,ULD结构域突变体TBK1回复突变之后同样能够恢复细胞正常生长速度,而激酶活性缺失突变体TBK1回复突变之后则不能够恢复细胞的正常生长速度;肿瘤细胞迁移实验发现,TBK1敲低之后细胞细胞迁移能力明显降低,TBK1野生型回复突变之后能够恢复细胞正常迁移能力,ULD结构域突变体TBK1回复突变之后也能够恢复细胞正常迁移能力,而激酶活性缺失突变体TBK1回复突变体之后则不能够恢复细胞正常迁移能力。综上所述,本研究发现TBK1丝氨酸激酶通过与ERα相互作用,进一步磷酸化ERα,从而增强其与转录因子结合并增强其转录活性,在此基础上促进乳腺癌细胞的增殖以及迁移。通过以上研究增强了对乳腺癌发生发展的分子机理的了解,并为乳腺癌的防治提供了潜在的新靶标。

全文目录

缩略词表  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-16
  一、雌激素受体α的结构与功能  11-13
  二、丝氨酸激酶TBK1 的结构与功能  13-16
材料与方法  16-23
  1. 菌株、细胞株及质粒  16
  2. 分子生物学工具酶  16
  3. TBK1 全长基因的获得  16
  4. 载体构建、引物合成及测序  16-18
  5. 转染质粒的制备  18
  6. 细胞培养与转染  18-19
  7. 免疫沉淀与免疫印迹  19-20
  8. 细胞中总RNA 的提取及RT-PCR  20-21
  9. 荧光素酶活性检测  21
  10. 体外激酶分析实验  21
  11. 细胞生长实验  21
  12. 肿瘤细胞迁移实验（细胞划痕法）  21-22
  13. 体外翻译实验  22
  14. 凝胶阻滞实验(Gel shift)  22-23
结果  23-46
  1.TBK1 激酶与ERα形成复合物  23-25
  2.TBK1 激酶与ERα相互作用的结构域  25-27
  3.TBK1 激酶使ERα磷酸化  27-30
  4.TBK1 RNAi 稳定细胞株及TBK1 RNAi/TBK1 回复细胞株的建立  30-31
  5.TBK1 激酶调节ERα的转录活性  31-39
  6.TBK1 调节ERα转录活性不依赖于其参与先天性免疫应答的功能  39-41
  7.TBK1 激酶通过ERα调控乳腺癌细胞的增殖与迁移  41-46
讨论  46-51
  1.TBK1 激酶与ERα形成复合物  46-47
  2.ERα为TBK1 激酶的底物  47
  3.TBK1 激活ERα的转录活性  47-49
  4. 第 305、309、468 和 578 位磷酸化位点可能的临床意义  49
  5. TBK1 是否与 ERα-36 存在相互作用  49
  6. TBK1 激酶对 ERα的磷酸化作用与乳腺癌发生相关  49-51
结论  51-52
参考文献  52-57
文献综述  57-67
  参考文献  61-67
个人简历  67-68
发表文章  68-69
致谢  69-70

丝氨酸激酶TBK1与雌激素受体α相互作用及其调控转录活性的研究

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