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新基因CCP22功能的初步研究

作　者: 冯帆
导　师: 叶棋浓
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: TGFβ/Smads通路蛋白质相互作用转录活性 CCP结构域细胞生长调控细胞癌变
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

TGFβ/Smads信号通路在细胞生长、分化、迁移和凋亡过程中发挥了重要的作用。在细胞中,TGFβ结合在TGFβ受体上后,将TGFβ受体活化,进而调节R-Smads(包括Smad2和Smad3)的磷酸化。磷酸化的R-Smads与效应Smad即Smad4形成异源复合物。Smads异源复合物从细胞质迁移进入细胞核后,能够参与调节多种目的基因的表达,并以此调控细胞的生长、分化和细胞癌变。在TGFβ信号途径中,存在有大量的共调节因子参与调节Smads的功能。这些共调节因子的种类和作用模式一向是研究的热点,现在已有许多新的共调节因子被鉴定出来,它们在TGFβ/Smads信号通路的各个环节都发挥了不同的作用,其相互之间的作用机制尚不十分清楚。因此,研究TGFβ/smads信号通路的各种共调节因子,分析和理解其调节机理对揭示多种肿瘤的发生、发展和转移机制都有重要意义。CCP结构域(complement control protein module, CCP module)最初在1987年被发现,现已在与补体调节和细胞免疫、机体排异和抵御微生物侵袭,甚至肿瘤发生发展等相关的多种分子中发现了这一结构域。含有CCP结构域的蛋白质一般分为两类,即补体激活调节蛋白质(regulators of complement activation, RCAs)和非补体激活调节蛋白质(non-RCAs)。不同的含有CCP结构域的蛋白质,其CCP结构域比较保守,每个蛋白可以含有多个CCP结构域,但数量上可有一定差异。研究表明,含有CCP结构域的蛋白质除含有CCP结构域外,还可能含有其它结构域,如跨膜结构域、受体结合结构域等。CCP结构域具有重要的功能,能够结合抗原分子,参与细胞信号识别等。CCP结构域除了参与免疫调节和细胞信号转导之外,还可能在细胞癌变调控中发挥一定作用。新基因CCP22是我们实验室利用酵母双杂交技术,以Smad4为诱饵从乳腺癌细胞文库中筛选到的一个含有CCP结构域并可以与Smad4相互作用的候选共调节因子。新基因CCP22能在多种细胞系和组织中表达,其编码的蛋白断裂成2个片段,分别称为CCP22-N和CCP22-C。免疫共沉淀实验证明它们都能与Smad2/3/4存在相互作用。CCP22能够与Smad4的MH2结构域的325-514aa区段结合。CCP22能够参与调节TGFβ/Smads信号途径的活性。实验表明,使用siRNA降低CCP22的表达能以TGFβ和Smad4依赖的方式升高TGFβ应答的报告基因活性,并升高TGFβ/Smads下游靶基因p15和p21的表达。锚定依赖的生长曲线检测表明,降低CCP22的表达水平能够显著抑制多种肿瘤细胞系的生长。这表明,在多种肿瘤细胞中,CCP22可能发挥促进细胞生长的作用。同时,肿瘤细胞生长的特点是锚定非依赖性生长能力。软琼脂实验表明,利用CCP22 siRNA降低CCP22的表达水平使多种肿瘤细胞系的锚定非依赖性生长能力显著下降。综上所述,CCP22可能是一新的负向调控TGFB/Smads信号途径的共调节因子,并有可能成为新的抗肿瘤的药物靶点。

全文目录

目录  3-5
英文缩写词表  5-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-15
材料与方法  15-26
  1.材料  15-17
    1.1 引物合成及序列测定  15
    1.2 菌株和细胞株  15
    1.3 质粒  15
    1.4 分子生物学工具酶  15
    1.5 常用试剂盒  15-16
    1.6 其它分子生物学试剂和化学试剂  16
    1.7 细胞培养试剂  16
    1.8 抗体  16
    1.9 主要实验仪器  16-17
  2.方法  17-26
    2.1 重组质粒构建与鉴定  17-20
      2.1.1 PCR扩增目的片段  18
      2.1.2 酶切聚合酶链式反应产物和相应的真核以及原核的蛋白表达载体  18-19
      2.1.3 酶切聚合酶链式反应产物和相应的真核以及原核的蛋白表达载体后将它们连接起来  19
      2.1.4 转化大肠杆菌感受态细胞,将重组质粒转化进入感受态细菌  19
      2.1.5 转化大肠杆菌感受态细胞,将重组质粒转化进入感受态细菌后重组子的筛选  19-20
      2.1.6 DNA片段的序列测定  20
    2.2 转染  20
    2.3 IP  20
    2.4 Western blot分析  20-21
    2.5 luciferase测定  21
    2.6 转录激活活性检测  21
    2.7 luciferase的转染方法  21
    2.8 siRNAs的表达载体的构建  21-22
    2.9 MTT绘制细胞生长曲线  22-23
    2.10 哺乳动物细胞混合克隆的制备  23
    2.11 肿瘤细胞的软琼脂成集落实验  23
    2.12 核质分离实验  23
    2.13 组织免疫染色  23-24
    2.14 细胞间接免疫荧光染色  24
    2.15 哺乳动物细胞周期测定  24-26
结果  26-56
  第一部分 CCP22抗体的制备与鉴定  26-30
    1.1 CCP22抗体的制备  26
    1.2 CCP22抗体的鉴定  26-28
    1.3 针对CCP22的siRNA能够降低CCP22内源片段的表达水平  28-29
    小结  29-30
  第二部分 CCP22在细胞株和组织中的表达及其亚细胞定位  30-38
    2.1 CCP22在细胞系中的表达鉴定  30
    2.2 CCP22在多种小鼠组织中都有表达  30-31
    2.3 CCP22-C能够被分泌到细胞外而CCP22-N则不能  31-32
    2.4 使用间接免疫荧光方法检测CCP22的亚细胞定位  32-33
    2.5 使用细胞核质分离方法检测CCP22的分布  33-34
    2.6 CCP22-N的亚细胞定位受到TGFβ调控  34-36
    2.7 CCP22在人乳腺癌和肝癌组织中的表达鉴定  36-37
    小结  37-38
  第三部分 CCP22与Smads蛋白的相互作用  38-41
    3.1 CCP22能够和Smad2/3/4相互作用  38-39
    3.2 CCP22能够和Smad4的MH2结构域相互作用  39-40
    小结  40-41
  第四部分 CCP22对TGFβ/Smads介导的转录活性的影响  41-51
    4.1 利用小干扰RNA(siRNA)降低CCP22表达对TGFβ/Smads介导的转录活性的影响  41-46
    4.2 CCP22对TGFβ/Smads介导的转录活性的调节作用依赖于Smad4  46-48
    4.3 TGFβ对CCP22 siRNA作用的剂量效应  48-49
    4.4 使用CCP22 siRNA降低CCP22的表达能升高TGFβ/Smads下游基因p15和p21的表达  49-50
    小结  50-51
  第五部分 CCP22对肿瘤细胞生长的调节作用  51-56
    5.1 使用CCP22 siRNA降低CCP22的表达能够降低多种肿瘤细胞的生长速度  51-52
    5.2 CCP22 siRNA能够抑制多种肿瘤细胞的锚定非依赖性生长  52-55
    小结  55-56
结论总结  56-57
讨论  57-60
研究展望  60-61
参考文献  61-64
文献综述  64-72
论文  72-80
个人简历  80-81
在读期间发表文章  81-82
致谢  82

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