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阿尔茨海默病重组B细胞表位Aβ1-15融合抗原疫苗研究

作　者: 王文斌
导　师: 孙志伟
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: 阿尔茨海默病载体分子辅助T细胞表位重组蛋白 DNA疫苗分子佐剂
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病,其主要特征是记忆减退、认知障碍。主要的病理表现包括细胞外淀粉样蛋白的堆积形成老年斑,细胞内Tau蛋白的磷酸化形成神经纤维缠结,并最终导致神经元的失营养坏死。淀粉样蛋白级联假说认为,患者大脑内堆积过多的Aβ42/Aβ40是导致阿尔茨海默病产生的主要原因。因此,以Aβ作为靶标治疗老年痴呆症的各种主动免疫和被动免疫治疗方法不断涌现。本研究针对免疫治疗阿尔茨海默病过程中出现的免疫原性和安全性问题,提出优化的策略设计新型疫苗。采用人源Aβ42的B细胞表位Aβ1-15多拷贝串联重复后,融合含有13aa的辅助T细胞表位PADRE构建了重组融合基因Aβ(1-15)6-T,加入A型肉毒毒素Hc片段后构建重组基因Aβ(1-15)6-T-AHc及Aβ(1-15)6-T-AHc-C。将以上基因分别克隆入原核表达载体和真核表达载体中,表达重组蛋白及构建DNA表位疫苗。同时研究白细胞介素4及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF等细胞因子作为分子佐剂对于阿尔茨海默病DNA疫苗的免疫调节作用和免疫效果的影响。将重组融合基因克隆入原核表达载体pTIG-Trx中,优化表达条件后实现了重组蛋白的可溶性表达,His亲和纯化后得到可用于下一步免疫实验的重组蛋白。其中,重组蛋白6Aβ及6Aβ-T经过分子量测定和肽谱分析表明具有特殊的二聚体结构,其功能结构尚需进一步研究确定。将四种重组蛋白6Aβ,6Aβ-T,6Aβ-T-AHc-C及AHc-5Aβ-T联合Al(OH)3佐剂免疫Balb/C小鼠,四次免疫后,小鼠体内产生了较高的抗Aβ42抗体,最高抗体滴度可以达到1:25000左右。添加了辅助T细胞表位和载体分子的重组蛋白免疫组抗体水平明显提高。抗体亚型分析结果显示,重组蛋白免疫后主要产生IgG1及IgG2b亚型抗体,表明免疫反应主要是Th2型。淋巴细胞增殖实验表明重组蛋白免疫组未引起明显的Th1型免疫炎症反应。免疫组脾细胞经PADRE刺激后产生了大量IL-4细胞因子,表明疫苗主要引起了Th2型免疫应答。研究表明,可溶性寡聚体的Aβ是大脑内毒性Aβ的主要形式,Dot-blot结果显示重组蛋白免疫后血清抗体特异性强结合Aβ寡聚体,弱结合单体,少或无结合纤维化状态的Aβ,提示我们重组蛋白免疫后产生的抗体可能能够特异性的清除或中和体内的Aβ42寡聚体,在AD免疫治疗中具有重大意义。重组蛋白6Aβ-T及6Aβ-T-AHc-C对转基因PDAPP小鼠进行免疫。实验结果表明,免疫组产生了针对Aβ42较高的抗体水平。抗体亚型分析结果说明其主要引起的Th2型免疫反应。细胞免疫水平测定结果与普通Balb/C小鼠相似,没有引起明显的针对Aβ42的淋巴细胞增殖。通过自发行为实验和Morris水迷宫实验证实,相比对照组,免疫组小鼠一定程度上提高了自主活动和空间学习记忆能力。免疫组化结果表明,重组蛋白免疫组小鼠大脑内海马区和皮质区的淀粉样斑块数量明显减少,斑块面积比例明显降低。重组融合基因导入真核表达载体pVAX1中,构建DNA表位疫苗。DNA质粒免疫Balb/C小鼠后产生了明显的抗体反应,融合了全长AHc片段的DNA表位疫苗pVAX1-S-Aβ(1-15)6-T-AHc产生的抗体水平最高,可以达到1:6400左右。抗体亚型分析其主要产生的是IgG1及IgG2b亚型抗体,表明免疫反应以Th2型为主。Dot-blot结果说明,DNA疫苗免疫后的血清抗体主要与寡聚体Aβ结合,与单体结合较弱,很少结合纤维状Aβ,提示这可能与我们设计的B细胞表位串联重复基因有关。将IL-4及GM-CSF基因克隆入含有信号肽序列的真核表达载体pVAX1-S中,构建分子佐剂载体pVAX1-S-IL-4和pVAX1-S-GM-CSF。与DNA表位疫苗共同免疫Balb/C小鼠。结果显示,两种分子佐剂对DNA疫苗免疫后的抗体水平都有一定提高作用,GM-CSF的作用效果更好,抗体滴度可以提高4倍左右。抗体亚型结果分析也表明,联合免疫组主要产生的是IgG1型抗体,说明分子佐剂的加入并未改变DNA疫苗的免疫应答途径。GM-CSF分子佐剂对于提高重组阿尔茨海默病DNA表位疫苗的效果具有一定作用,能够提高DNA表位疫苗的免疫原性。总结以上结果,我们设计了Aβ1-15重组融合基因,获得四种重组融合蛋白,其中两种融合了辅助T细胞表位和载体分子的重组蛋白免疫Balb/C小鼠和PDAPP小鼠后证明其具有良好的免疫原性。免疫反应偏向于Th2型,没有出现明显的针对Aβ的Th1型免疫应答。重组蛋白6Aβ-T和6Aβ-T-AHc-C能够明显减少转基因小鼠大脑内的淀粉样斑块含量以及改善自主活动和空间记忆能力,表明其可用于AD的免疫预防研究,具有十分重要的研究意义和应用前景。另外,我们设计的DNA疫苗具有良好的免疫原性,细胞因子类分子佐剂可以提高AD DNA表位疫苗的免疫效果。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
前言  11-19
  参考文献  15-19
第一部分阿尔茨海默病重组B细胞表位Aβ1-15融合蛋白疫苗研究  19-51
  1 阿尔茨海默病重组B细胞表位Aβ1-15融合蛋白疫苗在Balb  19-41
    1.1 材料  20-22
    1.2 方法  22-25
    1.3 结果  25-36
    1.4 讨论  36-38
    小结  38-39
    参考文献  39-41
  2 阿尔茨海默病重组B 细胞表位Aβ1-15 融合蛋白疫苗在PDAPP 小鼠免疫原性研究  41-51
    1.1 材料  41
    1.2 方法  41-43
    1.3 结果  43-48
    1.4 讨论  48-49
    小结  49
    参考文献  49-51
第二部分阿尔茨海默病重组B 细胞表位Aβ1-15 融合DNA 疫苗研究  51-71
  1 阿尔茨海默病重组B 细胞表位Aβ1-15 融合DNA 疫苗在Balb  51-63
    1.1 材料  52-53
    1.2 方法  53-55
    1.3 结果  55-61
    1.4 讨论  61-63
  2 分子佐剂对重组B 细胞表位Aβ1-15 融合DNA 疫苗免疫原性影响  63-68
    1.1 材料  64
    1.2 方法  64-65
    1.3 实验结果  65-67
    1.4 讨论  67-68
  小结  68-69
  参考文献  69-71
研究总结  71-73
文献综述  73-85
  参考文献  81-85
个人简历  85-86
致谢  86

阿尔茨海默病重组B细胞表位Aβ1-15融合抗原疫苗研究

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