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树突状细胞的标记及活体荧光成像示踪其在体内的分布归巢

作　者: 闫虎
导　师: 詹林盛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 荧光素酶报告基因 核心蛋白 水动力转染 活体荧光素酶双成像
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目前临床治疗乙型肝炎的常规药物是干扰素和核苷类似物,但这些药物很难完全清除患者体内的乙型肝炎病毒(HBV),而且有部分病人对这些药物无应答,因此,亟需发展新的治疗策略。当前认为HBV感染慢性化的主要原因是HBV特异性抗原提呈细胞功能低下,导致T细胞不能正常发挥细胞杀伤功能,从而有效清除病毒。树突状细胞(Dendritic cells, DCs)是存在于外周血和淋巴组织中的专职抗原提呈细胞,参与维持免疫耐受和调节T细胞介导的免疫反应。这些特性使得DCs可能会在过继性免疫治疗慢性HBV感染中发挥重要作用。早期的临床试验也证明了DCs用于治疗慢性HBV感染的可能性,但是对DCs在体内清除HBV的过程和机理还不十分清楚,阻碍了其用于乙型肝炎治疗的标准化进程。而研究DCs在疾病模型体内的分布和功能,可以促进免疫细胞治疗应用的标准化。本实验中,我们在体外用Gaussia荧光素酶标记分离的DCs,然后回输到Fluc标记的HBV模型小鼠体内,通过活体荧光成像对树突状疫苗在疾病模型小鼠体内的分布和迁移做了初步研究,具体研究内容如下:1.构建以IRES介导的膜锚定的Gluc或Fluc作为报告基因,含乙型肝炎病毒的核心蛋白(HBc)的腺病毒穿梭载体及其对照载体AD-HBc,AD-Fluc,AD-Fluc-HBc,AD-Gluc,AD-HBc-Gluc;经过重组包装后,得到相关的重组腺病毒;腺病毒经扩增和纯化对小鼠肝癌细胞系Hepa1-6的感染率达到95%以上;105个活细胞中Gluc的发光值可以达到107个光子数;体外Gluc的发光强度要比Fluc高两个数量级。2.将pUMVC3-Flt3L质粒分别在第1天和第6天转染小鼠,第12天观察小鼠脾脏和肝脏的变化;分离小鼠脾淋巴细胞,CD11c磁珠分离DCs后,流式细胞仪检测DCs表型和纯度。结果表明,经过两次水动力转染pUMVC3-Flt3L质粒的小鼠脾脏比未转染的小鼠大4-5倍,CD11c+细胞占脾脏淋巴细胞的数目30%左右,每只小鼠脾脏磁珠分离DCs的量可达5×107个,分离后小鼠DCs的纯度可达96%以上,而且分离的DCs表型并未发生变化,说明该方法可以扩增DCs且不影响DCs的成熟状态。3.将重组腺病毒AD-Gluc和AD- HBc-Gluc按MOI 200:1感染CD11c+ DCs,检测感染效率,活细胞水平检测Gluc的标记效率,通过活体荧光成像观察尾静脉注射和皮下注射的DCs在小鼠体内分布,以及通过双成像观察Gluc标记的DCs在Fluc标记的HBV小鼠模型体内分布。结果显示,重组腺病毒对脾脏来源的CD11c+ DCs感染效率约为50%,标记后106个DCs的发光值可达8×107个光子数。尾静脉输注Gluc标记的DCs 1 hr后很快分散到腹部器官,24 hr后DCs主要归巢到肠系膜淋巴结,在脾脏也有少量荧光素酶信号。皮下输注的标记DCs依然滞留在原处。本研究利用重组腺病毒技术,以Gluc作为报告基因标记荷载HBc的DCs,过继性输注到Fluc标记的HBV小鼠模型体内,联合活体荧光双成像技术,实时动态监测DCs在模型小鼠体内的分布、迁移,为临床前评价树突状疫苗治疗效果提供了直观、灵敏和便捷的手段。

全文目录


缩略语索引  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-14
第一章 腺病毒穿梭质粒的构建、包装及鉴定  14-34
  第一节 腺病毒穿梭质粒的构建及包装  15-24
    实验材料  15-17
    实验方法  17-22
    实验结果  22-24
  第二节 重组腺病毒的鉴定、纯化及感染  24-32
    实验材料  24-25
    实验方法  25-28
    实验结果  28-32
  讨论  32-34
第二章 活体荧光成像示踪标记的树突状细胞  34-48
  第一节 Flt3L 刺激的小鼠树突状细胞的增殖及分选  35-40
    实验方法  35-37
    实验结果  37-40
  第二节 树突状细胞的标记及在体内的示踪  40-46
    实验材料  40-41
    实验方法  41-42
    实验结果  42-46
  讨论  46-48
总结  48-49
参考文献  49-54
个人简历  54-56
致谢  56-58
综述  58-63
  参考文献  62-63

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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