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一株海洋细菌Renibacterium sp.QD1中的壳聚糖酶及其产酶条件研究

作　者: 邢培川
导　师: 于文功
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 壳聚糖酶分离纯化酶学性质基因克隆发酵优化
分类号: R284.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

壳聚糖（chitosan）也叫甲壳胺，它是由氨基葡萄糖及少量乙酰氨基葡萄糖残基通过β-1、4糖苷键连结而成的高聚物，是几丁质进一步脱乙酰基形成的产物。壳聚糖具有许多生理活性，但是由于多糖存在分子量大、不溶于水、生物利用度低等特点，其应用受到很大限制。相比于多糖寡糖具有高效、安全、生物利用度高等优点，而且壳寡糖不但保留了壳聚糖所具有的大部分性质，还具备独特的生理活性，如：防治糖尿病、降低胆固醇、降血压、消除脂肪肝等。传统的化学法、物理法制备寡糖的方法存在着反应条件难控制、降解产物不均一、环境污染严重等问题，已成为制约壳寡糖应用的瓶颈。相反，利用多糖降解酶制备壳寡糖，具有高效、特异、无污染、低成本等优点，因此，对壳聚糖酶的研究具有重要的意义。目前市面上已经商品化的壳聚糖酶非常少，而且存在活力低、生产成本高、价格昂贵等缺点，因此筛选具有工业化应用潜力的新酶十分必要。我们利用壳聚糖选择性培养基从青岛海域筛选到一株高产壳聚糖酶的菌株，对菌落的形态和16srDNA分析显示该菌株属于Renibacterium sp.菌属，命名为Renibacterium sp. QD1。菌株QD1为革兰氏阳性菌，它能够在以胶体壳聚糖为碳源的固体平板上生长并且产生透明圈。对QD1的发酵液采用盐析、疏水层析等方法分离得到一种电泳纯的壳聚糖酶Csn-A，其纯化效率达67%以上，纯化倍数为7.89倍。对Csn-A的基本酶学性质进行了研究，表明该酶的分子量大小为26.1kDa，酶的最适反应温度和pH分别为55℃和pH5.3-6.5，并且在<50℃、pH4-8范围内比较稳定。该酶能够被Fe³⁺, Cu²⁺, Al³⁺, Zn²⁺和SDS强烈抑制，但是Mn²⁺能够促进该酶的活性（约提高2倍）。对其降解产物分析发现其彻底降解产物为壳二糖和壳三糖。该酶的比活力可达1574.5U/mg，经优化发酵条件后粗酶液活力可达300-400U/ml。为了克隆得到Csn-A的编码基因，本文首先尝试了通过构建基因组文库的方法，用含有壳聚糖的LB培养基作为功能筛选的平板，结果显示壳聚糖对宿主菌DH5α的生长抑制非常严重，平板无法发挥功能筛选的作用，因而不能够筛选出阳性克隆子。继之，我们利用蛋白质N端测序技术对分离纯化得到的纯壳聚糖酶进行了蛋白质N端测序，获得了Csn-A的N端15个氨基酸的序列。对该段氨基酸序列进行比对和分析发现，其与Renibacterium salmoninarum（鲑鱼肾杆菌）中的一个壳聚糖酶具有很高的同源性，而且16srDNA序列也显示Renibacterium sp. QD1与Renibacterium salmoninarum的种属同源性达99%以上，推测两株菌的产酶序列上较为接近。因此我们利用Renibacteriumsalmoninarum已知的产壳聚糖酶基因序列设计引物进行PCR试验，结果得到了一段944碱基的序列，与Renibacterium salmoninarum产酶基因序列相似度达95%，与已经报道的Streptomyces N174产酶基因序列相似度达67%，并且该序列为糖苷水解酶46家族。对csn-A基因的克隆与分析，无疑丰富了壳聚糖酶基因的资源，推动了壳聚糖酶构效关系的研究。

一株海洋细菌Renibacterium sp.QD1中的壳聚糖酶及其产酶条件研究

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