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沙门氏菌属及其主要血清型的快速检测研究

作　者: 尹欢
导　师: 刘志国
学　校: 武汉工业学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 沙门氏菌 分型检测 环介导恒温扩增 靶基因
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


本研究建立沙门氏菌及其主要血清型的环介导恒温扩增（Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）方法，实现对沙门氏菌及其主要致病血清型的快速分型检测。通过序列同源性比较，确定沙门氏菌的属特异基因invE，及肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌三种血清型的血清型特异基因lygD、STM4495、fliC，并分别设计、合成特异LAMP扩增引物，均包括内引物对（FIP、BIP）和外引物对（F3、B3）。分别挑取沙门氏菌三种血清型纯培养单菌落，用煮沸法提取DNA模板。通过优化LAMP法操作中的各种条件，确定该法的最佳反应环境。分别选择肠炎、鼠伤寒、猪霍乱沙门氏菌标准株及几种非沙门氏菌菌株进行LAMP扩增，判断所设计的沙门氏菌属LAMP扩增引物和三种血清型引物的特异性。分别将纯培养2d的三种血清型菌株挑取单菌落，以生理盐水10倍梯度逐步稀释菌液，分别取各稀释菌液100μL进行平板计数，同时分别取各稀释菌液1mL提取DNA模板进行LAMP扩增检测LAMP法灵敏度，扩增产物分别采用凝胶电泳和直接在产物中加入SYBR-Green I染料两种方法检测。同时对提取的DNA模板进行PCR扩增，比较两种方法的灵敏度强弱。根据沙门氏菌各血清型的传播来源不同，分别选择不同的无菌食品样本人工添加目的菌种进行LAMP法扩增。结果显示采用沙门氏菌属特异性引物进行LAMP扩增，能特异的检出沙门氏菌三种血清型，而非沙门氏菌不能检出；分别采用三种血清型特异性引物进行扩增，三种血清型之间无交叉反应，且非沙门氏菌均不能检出，表明所设计的沙门氏菌属和血清型扩增引物特异性强。LAMP法针对invE基因细菌纯培养液检出限为2.0×10~1CFU/mL，PCR法检出限为2.33×10~3CFU/mL，而三种血清型细菌培养液LAMP法检出限分别为2.33×101CFU/mL、1.67×10~1CFU/mL、1.33×10~1CFU/mL，PCR法检出限分别为1.33×10~3CFU/mL、2.17×10~2CFU/mL、1.67×10~2CFU/mL，表明与PCR法相比，LAMP法的灵敏度高101~102倍。沙门氏菌属及三种血清型模拟样本检出限分别为1.67×10~1CFU/mL、2.67×10~1CFU/mL、2.0×10~1CFU/mL、2.0×10~1CFU/mL，基本与细菌纯培养液检出限一致，表明食品样本中潜在的干扰物质对LAMP反应体系影响不大。综上所述，LAMP法反应灵敏度高、特异性强，可用于食品中沙门氏菌及其主要血清型的快速检测。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第1章 综述  11-23
  1.1 沙门氏菌简介  11-14
    1.1.1 分类  11-12
    1.1.2 沙门氏菌的性质及危害  12-14
  1.2 沙门氏菌的检测方法  14-18
    1.2.1 传统的培养鉴定方法  14-15
    1.2.2 以抗体为基础的检测方法  15-16
    1.2.3 以核酸为基础的检测方法  16-18
  1.3 环介导恒温扩增方法简介  18-22
    1.3.1 环介导等温扩增法的原理  18-21
    1.3.2 环介导恒温扩增法的特点  21
    1.3.3 LAMP 技术检测中的应用  21-22
  1.4 研究目的与意义  22-23
第2章 靶基因的同源性分析研究  23-34
  2.1 方法  23
    2.1.1 靶序列同源性比对  23
    2.1.2 LAMP 扩增引物设计  23
  2.2 结果  23-32
    2.2.1 靶序列同源性比对  23-29
    2.2.2 LAMP 扩增引物设计  29-32
  2.3 讨论  32-34
第3章 沙门氏菌属及其主要血清型 LAMP 检测方法的建立  34-56
  3.1 材料  34-35
    3.1.1 菌种与试剂  34-35
    3.1.2 仪器与设备  35
  3.2 方法  35-39
    3.2.1 DNA 模板的制备  35-36
    3.2.2 引物合成  36
    3.2.3 LAMP 反应及条件优化  36
    3.2.4 LAMP 特异性检测  36
    3.2.5 LAMP 灵敏度检测  36-38
    3.2.6 食品模拟样本的 LAMP 检测  38-39
  3.3 结果  39-54
    3.3.1 沙门氏菌属 LAMP 方法的建立  39-42
    3.3.2 三种主要血清型 LAMP 检测方法的建立  42-54
  3.4 讨论  54-56
第4章 结论  56-58
参考文献  58-64
致谢  64-65
附录 A  65-75
攻读学位期间的研究成果  75

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 微生物学检验
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