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miR-10a对肝癌细胞迁移、侵袭的影响及其靶基因的确定

作　者: 罗悦晨
导　师: 汤华
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: miR-10a 迁移侵袭靶基因 EPHA4
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：肿瘤的迁移和侵袭是多基因参与、多步骤完成的复杂生命现象,其发生的隐蔽性和不可预测性是肿瘤患者治疗过程中最重要的难题,也是威胁肿瘤患者生命的最重要原因。目前,对于其发生机制的研究已取得了很多的成就,microRNA(miRNA)的发现又使这一领域的研究有所扩展。miRNA属于小RNA分子家族,能通过与3’非翻译区(3’UTR)带有互补序列的靶基因互补结合,引起靶基因mRNA的降解或翻译抑制,从而发挥对靶基因表达的调控作用。研究表明,miRNA的调节作用涵盖了生长发育,细胞凋亡,造血细胞分化,脂肪代谢等多种生命过程。在肿瘤组织中,也存在miRNA的差异表达,提示人们miRNA可能参与肿瘤的某些生物学特性的形成。此研究的目的即探寻是否miRNA参与了肝癌细胞迁移和侵袭的调控过程,这一调控过程是通过哪些基因实现的。方法：本实验室的前期工作表明miR-10a是抑制结肠癌细胞转移的重要miRNA,其可能是通过调节MMP14的表达来发挥作用。为了研究miR-10a对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响,我们进行了深入的研究。细胞迁移及侵袭实验中,过表达或封闭掉miR-10a后,细胞的迁移及侵袭能力发生了变化。同时用MTT,平板克隆形成实验检测了miR-10a对细胞活性及增殖能力的影响。在确认miR-10a与肝癌细胞迁移及侵袭表型相关之后,我们通过生物信息学方法预测其靶基因,挑选了其中一个与肿瘤转移过程密切相关的靶基因EPHA4为研究对象。在接下来的实验中,我们构建了带有EPHA4的3’UTR miR-10a靶位点的报告基因载体,在肝癌细胞系中检测miR-10a对报告基因表达水平的影响,来验证EPHA4是否为miR-10a的靶基因。此后,又通过Real-time PCR和Western blot方法检测了miR-10a对EPHA4的mRNA和蛋白水平的影响。构建的质粒pSilenser/EPHA4-shRNA对细胞表型的影响,进一步验证EPHA4是否为miR-10a的靶基因。结果：细胞迁移及侵袭实验的结果表明,过表达miR-10a能促进肝癌细胞的迁移和侵袭,封闭掉miR-10a能降低肝癌细胞的迁移和侵袭能力,且并不影响细胞的活性及增殖能力。报告基因载体实验表明miR-10a能够抑制带有EPHA4靶位点的报告基因表达载体的表达。Real-time PCR和Western blot的结果表明miR-10a能够影响EPHA4的mRNA和蛋白水平。pSilenser/EPHA4-shRNA质粒对细胞表型的影响与过表达miR-10a对细胞表型的影响一致。结论：miR-10a是促进肝癌细胞迁移和侵袭的重要miRNA,其发挥调节作用可能是通过调节EPHA4表达来实现的。

miR-10a对肝癌细胞迁移、侵袭的影响及其靶基因的确定

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