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MicroRNA-222在结肠癌细胞系中的生物学作用及机制研究

作　者: 丛雪晶
导　师: 白春梅
学　校: 北京协和医学院
专　业: 临床医学
关键词: miR-222 结直肠癌 生物学作用 靶基因
分类号: R735.35
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界上发病率第三位的恶性肿瘤,居于恶性肿瘤相关死亡原因第四位。尽管近年来手术、化疗、放疗和靶向治疗等治疗方法有了较大进步,但CRC的高转移率和高病死率仍是重大的难题,IV期患者的5年生存率仍仅有8.1%。因此进一步阐明结直肠癌发生发展的分子机制,尤其是肿瘤转移的机制,采取个体化治疗,成为结直肠癌研究的热点。MicroRNA (miRNA)是一种约18~22个核苷酸的单链非编码RNA,通过与靶mRNA的3’UTR区完全或不完全互补结合的方式,介导mRNA降解或翻译抑制,从转录后水平调控基因表达。miRNAs广泛存在于各种组织中,参与细胞增殖、分化、凋亡等过程,其异常缺失或增多与各种肿瘤的发生发展相关。北京协和医院肿瘤内科在结直肠癌组织标本miRNAs表达谱的研究中发现,与癌旁组织相比,miR-222表达量升高,与国外的研究报道一致,提示miR-222可能对CRC的发生发展有促进作用。然而目前尚无miR-222在结直肠癌中作用机制的报道。本研究采用脂质体转染法在结肠癌细胞系HCT8和HCT116中转染miR-222mimics和miR-222inhibitor,造成细胞系中miR-222过表达和抑制,通过real-time PCR方法验证转染效率。观察miR-222过表达和抑制后结肠癌细胞系增殖、周期、凋亡、迁移和化疗药物敏感性的变化,并对miR-222的作用机制做了初步探讨。第一部分观察miR-222对HCT8和HCT116生物学行为的影响。通过MTS实验,发现miR-222过表达和抑制的HCT8和HCT116与过表达对照和抑制对照相比,在不同时间细胞增值率没有统计学差异(1、2、3天miR-222mimics vs mimics control P>0.05; miR-222inhibitor vs inhibitor control P>0.05);用流式细胞仪测定处于G0/G1、S、G2/M期细胞的百分比,发现miR-222过表达和抑制的HCT8和HCT116与各自对照相比,各期的百分比没有统计学差异(GO/G1、S、G2/M期miR-222mimics vs mimics control P>0.05; miR-222inhibitor vs inhibitor control P>0.05);将细胞用Annexin V/PI处理,流式细胞仪检测处于早期凋亡和晚期凋亡的细胞百分比,发现miR-222过表达和抑制的HCT8和HCT116与各自对照相比,在早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例均较少,没有统计学差异(早期凋亡和晚期凋亡miR-222mimics vs mimics control P>0.05; miR-222inhibitor vs inhibitor control P>0.05);用transwell进行细胞迁移试验,发现miR-222过表达的HCT8穿过transwell膜的细胞数更多(96.315±13.14vs mimics control43.18±8.06, P<0.001), miR-222受抑制的HCT8穿过transwell膜的细胞数少(9.31±3.62vs inhibitor control46.56±6.81, P<0.001)。以上结果提示miR-222对HCT8和HCT116细胞系的增殖、周期、凋亡没有明显促进或抑制作用,但miR-222能促进HCT8细胞系的迁移。第二部分观察miR-222对HCT8细胞系化疗药物敏感性的影响。将5-氟尿嘧啶和奥沙利铂以不同浓度和不同时间作用于miR-222过表达和抑制的HCT8细胞系,用MTS法反映细胞数量,计算药物抑制率,发现miR-222过表达和抑制的细胞与各自对照相比,在特定药物浓度和特定时间的细胞抑制率没有统计学差别(两种药物在特定浓度和特定时间miR-222mimics vs mimics control P>0.05; miR-222inhibitor vs inhibitor control P>0.05),提示miR-222不影响HCT8细胞系对5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的敏感性。第三部分预测了miR-222与促进迁移有关的靶基因。通过miRNAs靶基因预测软件TargetScan和Pictar对miR-222的靶基因进行预测,发现TIMP2、RECK、MIA3、 STK24、PLXNC1能抑制肿瘤细胞迁移,且3’UTR区有一个或两个位点与miR-222的种子序列完全互补,提示TIMP2、RECK、MIA3、STK24、PLXNC1可能是miR-222的靶基因。以上结果表明miR-222对结肠癌细胞系HCT8和HCT116的增殖、周期、凋亡和化疗药物敏感性没有影响；miR-222能促进HCT8细胞系迁移；预测miR-222促进迁移的靶基因可能是TIMP2、RECK、MIA3、STK24、PLXNCl。本研究首次关注miR-222在结肠癌细胞系中的生物学作用及其对化疗药物敏感性的影响,并对其作用机制进行了初步探讨。为进一步阐明miR-222在结直肠癌发生发展中的机制奠定了基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
前言  8-10
第一部分 miR-222对HCT8和HCT116生物学行为的影响  10-31
  引言  10
  实验材料和方法  10-15
  实验结果  15-25
  讨论  25-31
第二部分 miR-222对HCT8药物敏感性的影响  31-38
  引言  31
  实验材料和方法  31-32
  实验结果  32-36
  讨论  36-38
第三部分 miR-222促进肿瘤细胞迁移的下游靶基因预测  38-45
  引言  38
  实验材料和方法  38-39
  实验结果  39-40
  讨论  40-45
结论  45-46
不足与展望  46-47
参考文献  47-52
文献综述  52-69
  参考文献  64-69
主要缩略词表  69-71
个人简历  71-72
致谢  72-73

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 结肠肿瘤
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