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微生物转化法制备普瑞巴林手性中间体

作　者: 吴薇
导　师: 杨立荣；吴坚平
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 普瑞巴林 (S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基已酸乙酯 假单胞菌 对映选择性 静息细胞
分类号: TQ463
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 111次
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内容摘要


普瑞巴林(Pregabalin),(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸,是一种用于抗神经痛和癫痫症的辅助治疗的手性药物,其国际市场需求呈现较快增长之势。开展生物催化法制备普瑞巴林的研究,筛选拆分制备普瑞巴林的微生物,具有重要的应用前景和价值。(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯((S)-CCMAE)是合成普瑞巴林的关键手性中间体。本文首先以外消旋体2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CCMAE)为底物,从土壤中筛选得到一株具有自主知识产权的能够对映选择性水解(R)-CCMAE的假单胞菌(Pseudomonas) CGMCC No.4184。对其产酶条件及培养基进行了优化,使酶活从15.92 U/L提高到33.43 U/L。随后对假单胞菌CGMCCNo.4184静息细胞水解拆分底物的反应条件进行了研究,确定了较优反应条件为：30～35℃,pH 7.5-8.5。并成功利用微生物静息细胞转化法制备了ee值达99.8%的(S)-CCMAE,这与目前报道的生物拆分工艺均有所不同。研究还发现Tween-80和TritonX-100可明显提高对映选择率E值和酶活。最后利用海藻酸钠-PVA复合载体法制备了假单胞菌CGMCC No.4184的固定化细胞,对其技术参数和反应条件作了优化,并利用所制得的固定化细胞制备ee值99%以上的(S)-CCMAE。该固定化细胞能够较好地进行重复利用。本研究中筛选获得的高选择性R型水解酶可能是一种新酶,后续的基因克隆和表达、酶学性质研究工作正在进行中,为进一步改善酶的催化性能和拓展应用范围打下了良好的基础。

全文目录


致谢  6-7
摘要  7-8
ABSTRACT  8-12
第一章 文献综述  12-28
  1.1 绪论  12-14
    1.1.1 普瑞巴林  12
    1.1.2 普瑞巴林的市场前景  12-14
  1.2 国内外研究进展  14-23
    1.2.1 不对称合成法  14-17
    1.2.2 外消旋体拆分法  17-22
    1.2.3 普瑞巴林制备方法的比较  22-23
  1.3 本课题的研究意义  23-24
  1.4 本课题的研究意义  24-25
  1.5 本课题的研究思路和内容  25-28
第二章 选择性水解CCMAE菌种的筛选及鉴定  28-40
  2.1 前言  28
  2.2 实验材料  28-30
    2.2.1 土壤样品来源  28
    2.2.2 培养基  28-29
    2.2.3 试剂  29
    2.2.4 仪器  29-30
  2.3 菌种筛选  30-31
    2.3.1 筛选方法  30
    2.3.2 土样采集  30
    2.3.3 富集培养  30-31
    2.3.4 菌种的分离纯化  31
    2.3.5 菌种初筛  31
    2.3.6 菌种复筛  31
  2.4 菌株鉴定  31-32
  2.5 分析及计算方法  32-33
    2.5.1 分析方法  32-33
    2.5.2 转化率、ee值和对映体选择率E的计算方法  33
  2.6 结果与讨论  33-37
    2.6.1 菌株筛选结果  33-35
    2.6.2 菌株鉴定结果  35-37
  2.7 本章小结  37-40
第三章 菌株产酶条件的优化  40-50
  3.1 前言  40
  3.2 材料与方法  40-42
    3.2.1 培养基组成  40
    3.2.2 仪器试剂  40
    3.2.3 培养条件  40
    3.2.4 有效产酶部位的确定  40-41
    3.2.5 酶活定义及测定  41
    3.2.6 产酶条件优化  41-42
    3.2.7 静息细胞转化底物  42
  3.3 结果与讨论  42-49
    3.3.1 有效产酶部位的确定  42-43
    3.3.2 温度与初始pH对产酶的影响  43-44
    3.3.3 不同碳源、氮源和金属离子对产酶的影响  44-45
    3.3.4 Plackett-Burman试验  45
    3.3.5 最陡爬坡试验  45-46
    3.3.6 响应面法优化产酶条件  46-47
    3.3.7 优化后假单胞菌CGMCC No.4184的生长-产酶曲线  47-48
    3.3.8 静息细胞法拆分底物CCMAE的初步研究  48-49
  3.4 本章小结  49-50
第四章 目标菌选择性水解CCMAE反应条件的研究  50-60
  4.1 前言  50
  4.2 材料与方法  50-52
    4.2.1 培养基组成  50-51
    4.2.2 仪器试剂  51
    4.2.3 培养条件  51
    4.2.4 静息细胞法转化底物  51
    4.2.5 酶活定义及测定  51-52
  4.3 结果与讨论  52-58
    4.3.1 温度和pH对拆分效果的影响  52-53
    4.3.2 不同表面活性剂剂和共溶剂对拆分效果的影响  53-55
    4.3.3 不同底物浓度对拆分效果的影响  55-56
    4.3.4 游离细胞稳定性研究  56-58
  4.4 本章小结  58-60
第五章 固定化细胞拆分CCMAE的初步研究  60-76
  5.1 前言  60-62
  5.2 材料与方法  62-64
    5.2.1 培养基组成  62
    5.2.2 仪器试剂  62
    5.2.3 培养条件  62
    5.2.4 固定化细胞制备方法  62-63
    5.2.5 酶活测定  63-64
    5.2.6 机械强度测定  64
  5.3 结果与讨论  64-74
    5.3.1 不同固定化方法的比较  64-65
    5.3.2 游离细胞与固定化细胞的比较  65-66
    5.3.3 海藻酸钙-PVA复合载体制备固定化细胞的条件优化  66-71
    5.3.4 固定化细胞转化条件的初步优化  71-74
    5.3.5 固定化细胞的反复批式试验  74
  5.4 本章小结  74-76
第六章 结论与展望  76-78
  6.1 结论  76-77
  6.2 建议  77-78
参考文献  78-88
作者简历  88

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 有机化合物药物的生产
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