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盾壳霉小RNA相关通路基因的功能研究

作　者: 曾丽斯
导　师: 付艳苹; 程家森
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 盾壳霉小RNA AGO DCL1 DCL2
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

盾壳霉(Coniothyrium minitans)是植物病原菌核盘菌(Scleroinia sclerotiorum)的重寄生真菌。小RNA调控通路广泛存在于高等和低等生物体内,其中Dicer酶在小RNA的加工过程中起重要的剪切作用,AGO蛋白则是小RNA行使功能的RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC)中的重要成员。这些基因在动植物以及部分真菌中的功能已有研究报道,但在盾壳霉中这些基因的功能尚不明确,本文对盾壳霉的AGO、DCL1及DCL2基因的功能进行了相关研究。首先我们通过RT-PCR证实了CmAGO、CmDCL1和CmDCL2在盾壳霉的生长和产孢等阶段均有表达。根据同源重组的原理构建了这三个基因的敲除载体,通过农杆菌介导转化盾壳霉分生孢子,经PCR和Southern杂交验证分别得到了3个CmAGO敲除转化子,4个CmDCL1敲除转化子和8个CmDCL2敲除转化子。构建了相关基因的互补载体,并得到了3个CmDCL2基因的互补转化子。进一步研究表明,在PDA培养基上,CmAGO、CmDCL1和CmDCL2敲除转化子的菌落、菌丝及孢子形态与出发菌株ZS-1相比均无显著差异,但生长速度、寄生致腐核盘菌菌核能力均显著低于出发菌株ZS-1；产孢量、产抗真菌物质能力均显著高于出发菌株ZS-1; CmAGO敲除转化子孢子萌发速率显著高于出发菌株ZS-1；核盘菌Ep-1PNA367与三个基因敲除转化子对峙培养时,两菌菌丝融合会促进敲除转化子在交界处产孢增加；CmAGO和CmDCL2敲除转化子与带病毒的灰霉菌Bc10HN454菌株对峙培养可获得病毒,CmAGO和CmDCL2敲除转化子感染BcHV/10HN454和BcTV/10HN454病毒后,表型发生显著变化,CmDCL2敲除转化子产孢量明显减少,CmAGO敲除转化子不产孢。CmDCL2互补转化子在生物学性状各方面测定中均与出发菌株ZS-1无显著差异。上述研究结果表明CmAGO、CmDCLl和CmDCL2基因在盾壳霉的生长发育和寄生核盘菌等方面发挥重要作用。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
缩略语表  9-11
第一章文献综述  11-19
  1 盾壳霉简介  11-12
    1.1 盾壳霉的生物学特征  11
    1.2 盾壳霉的生防机制  11-12
  2 小RNA简介  12-14
    2.1 小RNA的特征  12
    2.2 小RNA的功能  12-14
  3 小RNA相关通路基因的研究  14-18
    3.1 Dicer及其相关研究  14-16
      3.1.1 Dicer的结构  14
      3.1.2 Dicer的功能  14-16
    3.2 AGO的研究  16-18
      3.2.1 AGO蛋白家族  16
      3.2.2 AGO蛋白的功能  16-18
  4 选题的目的与意义  18-19
第二章盾壳霉AGO、DCL1和DCL2基因的功能验证  19-50
  1 材料和方法  19-35
    1.1 材料  19-21
      1.1.1 菌株、载体  19
      1.1.2 培养基、试剂  19-20
      1.1.3 抗生素  20
      1.1.4 杂交药品  20-21
      1.1.5 试剂盒  21
    1.2 方法  21-35
      1.2.1 小RNA相关通路基因在盾壳霉的表达情况  21-22
        1.2.1.1 盾壳霉总RNA提取  21
        1.2.1.2 RNA反转录合成cDNA第一链  21-22
      1.2.2 基因敲除载体的构建  22-26
        1.2.2.1 CmDCL2基因敲除载体的构建  22-24
        1.2.2.2 CmAGO、CmDCL1基因敲除载体的构建  24-26
      1.2.3 含重组质粒农杆菌的获取和转化  26-27
        1.2.3.1 含重组质粒农杆菌的获取  26
        1.2.3.2 农杆菌介导敲除载体转化盾壳霉ZS-1  26-27
      1.2.4 敲除转化子的PCR和RT-PCR鉴定  27
      1.2.5 敲除转化子的Southern杂交鉴定  27-30
        1.2.5.1 基因组DNA的大量提取  27-28
        1.2.5.2 基因组DNA酶切  28
        1.2.5.3 电泳、转膜及固定  28-29
        1.2.5.4 预杂交  29
        1.2.5.5 探针的标记和杂交  29-30
        1.2.5.6 洗膜、压片及探针的洗脱  30
      1.2.6 互补载体的构建  30-31
      1.2.7 含重组质粒农杆菌的获取和转化  31
        1.2.7.1 含重组质粒农杆菌的获取  31
        1.2.7.2 农杆菌介导互补载体转化CmAGO-KO117、CmDCL1-KO12和CmDCL2-KO100菌株  31
      1.2.8 互补转化子的PCR和RT-PCR鉴定  31-32
      1.2.9 转化子的生物学性状测定  32-35
        1.2.9.1 转化子菌落形态观察  32
        1.2.9.2 转化子菌丝显微观察  32
        1.2.9.3 转化子孢子形态观察  32
        1.2.9.4 转化子菌丝生长速度测定  32
        1.2.9.5 转化子产孢量检测  32-33
        1.2.9.6 转化子孢子萌发试验  33
        1.2.9.7 转化子寄生致腐核盘菌菌核能力的检测  33
        1.2.9.8 转化子与核盘菌菌株Ep-1PNA367的对峙培养试验  33-34
        1.2.9.9 转化子产抗真菌物质的测定  34
        1.2.9.10 转化子与Bc-10HN454菌株对峙培养  34-35
  2 结果与分析  35-50
    2.1 CmAGO、CmDCL1和CmDCL2的表达检测  35-36
    2.2 敲除载体的鉴定  36
    2.3 敲除转化子的PCR验证及表达量检测  36-37
    2.4 敲除转化子的Southern Blot验证  37-38
    2.5 CmDCL2互补载体的鉴定  38-39
      2.5.1 CmDCL2互补载体的大肠杆菌菌液测序结果  38
      2.5.2 CmDCL2互补载体的农杆菌菌液PCR验证  38-39
    2.6 CmDCL2互补转化子的PCR验证及表达量检测  39-40
      2.6.1 CmDCL2互补转化子的PCR鉴定  39
      2.6.2 CmDCL2互补转化子的RT-PCR鉴定  39-40
    2.7 转化子的生物学性状测定  40-50
      2.7.1 转化子的菌落形态观察  40-41
      2.7.2 转化子的菌丝形态观察  41
      2.7.3 转化子的孢子形态观察  41-42
      2.7.4 转化子的菌丝生长速度测定  42
      2.7.5 转化子的产孢能力测定  42-43
      2.7.6 转化子孢子萌发速率的测定  43-44
      2.7.7 转化子寄生致腐核盘菌菌株Ep-1PNA367能力测定  44-46
      2.7.8 转化子与核盘菌Ep-1PNA367对峙培养试验  46
      2.7.9 转化子抗真菌物质的能力测定  46-47
      2.7.10 转化子与Bc-10HN454菌株对峙培养  47-50
第三章结论与展望  50-53
  1 讨论  50-51
  2 结论与展望  51-53
参考文献  53-62
致谢  62

盾壳霉小RNA相关通路基因的功能研究

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