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利用人工设计小RNA抑制铜绿假单胞菌的致病因子表达

作　者: 苗翠翠
导　师: 于文功
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生药学
关键词: 细菌耐药人工反式编码小RNA 铜绿假单胞菌群体感应
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

铜绿假单胞菌是临床常见的机会性致病菌,也是目前抗生素耐药最严重的病原菌之一。近几年来,人们提出了靶向细菌致病力的抗感染新思路。针对细菌的某些特定致病机制(如结合、侵入、毒素分泌、破坏宿主防护和信息系统等)靶向阻断其致病过程,从而剥夺其致病力,达到抗感染的目的。与传统的抗感染思路完全不同,它不影响细菌生长,因此不会产生细菌耐药现象,也避免了抗生素所造成的体内微生态紊乱,为有效地控制细菌感染带来了新的机遇和挑战。最近,在细菌体内发现了一类普遍存在、长度在50～200个核苷酸、不能编码蛋白质的RNA,称为细菌非编码小RNA(sRNA)。sRNA在细菌的物质代谢、环境适应、细菌致病力等方面发挥重要的调节作用。在真核生物中,RNAi技术作为一种基因沉默的有效工具得到了广泛的应用,并且已发展成为一种最有前途的疾病防治新方法。在前期研究中,我们分析了大肠杆菌内源非编码小RNA的结构特征,首次建立了人工反式编码小RNA(artificial trans-encoded sRNA, atsRNA)的设计原则,并在大肠杆菌中成功地对靶基因进行了有效的沉默。本文旨在利用人工设计反式编码小RNA干扰铜绿假单胞菌的毒力因子表达并降低致病力,为抗感染和解决细菌耐药难题提供崭新的技术和方法。首先,我们分析了已知铜绿假单胞菌内源非编码小RNA的共同结构特征,提出了针对铜绿假单胞菌的atsRNA设计原则。以铜绿假单胞菌单基因控制的毒力因子弹性蛋白酶和外毒素A为靶点,分别设计了SRLB和SRTX系列atsRNAs;在铜绿假单胞菌中过量表达atsRNA,并检测靶基因表达水平。实验结果表明,弹性蛋白酶在SRLB2的干扰下,蛋白表达水平降低了57%, mRNA转录水平下降34.9%；外毒素A在SRTX1作用下转录水平表达降低了30.6%。其次,针对phzABCDEFG操纵子控制的毒力因子绿脓菌素,设计了SRphF系列和SRpzA系列atsRNAS。其中SRphF系列的靶基因phzF是phz操纵子中的第六个基因,编码绿脓菌素合成的关键酶；SRpzA系列的靶基因phzA是phz操纵子第一个基因,与phz启动子区域紧密相连。实验结果显示SRphF系列小RNA干扰效果不明显,效果最好的SRphF2只使绿脓菌素合成量降低了15.8%；而SRphA系列干扰效果较好,SRpzA2干扰效率达到56%,SRpzA3能达到37%。以上说明,以操纵子控制的毒力因子为靶标设计atsRNA时,操纵子最前端基因的核糖体结合位点是有效干扰靶点。在此基础上,构建了靶基因-荧光蛋白融合载体pACYC-T7-phzF-EGFP,并在大肠杆菌BL21中共表达了SRphF系列atsRNAs和pACYC-T7-phzF-EGFP。荧光检测结果显示,在铜绿假单胞菌中干扰效率极低的SRphF系列人工反式编码小RNA在大肠杆菌BL21内干扰效果显著,SRphF2、3、5干扰后荧光表达量均有下降。其中SRphF2干扰后,pACYC-T7-phzF-EGFP荧光表达量下降了83.5%,远远高于其在铜绿假单胞菌种的干扰效率15.4%。这一实验结果表明,两种细菌中atsRNAs的干扰作用存在一定差异。最后,针对铜绿假单胞菌群体感应rhl和las系统的调控蛋白RhlR和LasR设计了SRlaR和SRrhR系列的atsRNAs。RT-PCR检测结果表明,SRrhlR4使PAO1菌株rhlR在mRNA水平上降低了79%,并使受rhl系统控制的下游弹性蛋白酶活力降低了36.4%；SRlaR3降低了lasR mRNA的63%,弹性蛋白酶活力降低了32.7%。近年来的研究表明,干扰细菌的群体感应系统可以作为潜在的防治细菌病害的新途径,我们通过SRlaR和SRrhR系列的atsRNAs成功干扰了rhlR, lasR基因的表达,并一定程度上降低了毒力因子弹性蛋白酶的合成。综上所述,我们初步建立了一种在铜绿假单胞菌中利用atsRNA干扰毒力因子表达的方法。通过对单基因控制的毒力靶点、操纵子控制的绿脓菌素以及群体感应调控基因的有效干扰,从一定程度上降低了铜绿假单胞菌的致病力,为铜绿假单胞菌引起的相关感染的防治提供了新途径,并为解决细菌耐药难题创造了条件。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
0 前言  13-34
  0.1 细菌耐药性的研究现状  13
  0.2 铜绿假单胞菌的感染现状  13-22
  0.3 解决耐药性的策略  22-23
  0.4 RNA干扰技术  23-26
  0.5 反义核酸技术  26-27
  0.6 人工反式编码小RNA技术  27-34
1 针对单基因控制的弹性蛋白酶和外毒素A设计atsRNAs  34-54
  1.1 实验材料和仪器  35-37
  1.2 方法  37-48
    1.2.1 构建铜绿假单胞菌atsRNA表达载体PRPA  37-41
    1.2.2 针对弹性蛋白酶和外毒素A设计atsRNAs  41-45
    1.2.3 转化atsRNAs至铜绿假单胞菌PAO1  45-48
    1.2.4 弹性蛋白酶活性测定  48
  1.3 结果  48-53
    1.3.1 铜绿假单胞菌中atsRNA表达载体的鉴定  48-49
    1.3.2 atsRNAs退火和磷酸化鉴定  49
    1.3.3 SRBL和SRTX系列atsRNAs干扰载体连接鉴定  49-50
    1.3.4 弹性蛋白酶活性测定结果  50
    1.3.5 RT-PCR鉴定lasB mRNA的表达  50-51
    1.3.6 RT-PCR鉴定外毒素A mRNA的表达  51-52
    1.3.7 atsRNAs对铜绿假单胞菌PA01生长的影响  52-53
  1.4 讨论  53-54
2 针对phz操纵子控制合成的绿脓菌素设计atsRNAs  54-67
  2.1 实验材料和仪器  55
  2.2 方法  55-60
    2.2.1 针对phz操纵子中的phzF基因设计atsRNAs  55-56
    2.2.2 转化atsRNAs至铜绿假单胞菌PAO1  56-57
    2.2.3 绿脓菌素的测定  57
    2.2.4 构建大肠杆菌靶-荧光蛋白融合载体pACYC-T7-phzF-EGF  57-59
    2.2.5 针对phz操作子中phzA基因设计atsRNAs  59-60
    2.2.6 转化atsRNAs至铜绿假单胞菌PAO1并检测干扰效果  60
  2.3 结果  60-65
    2.3.1 SRphF系列atsRNAs干扰载体连接鉴定  60-61
    2.3.2 SRphF系列atsRNAs对绿脓菌素表达的影响  61
    2.3.3 PCR鉴定pACYC-T7-phzF-EGFP载体构建  61-62
    2.3.4 检测SRphF系列atsRNAs在大肠杆菌中的干扰情况  62-63
    2.3.5 RT-PCR检测SRphF2表达量  63
    2.3.6 SRpzA系列atsRNAs对绿脓菌素表达的影响  63-64
    2.3.7 IPTG浓度对绿脓菌素合成量的影响  64-65
  2.4 讨论  65-67
3 atsRNAs干扰群体感应调控蛋白LasR和RhlR  67-75
  3.1 实验材料和仪器  68
  3.2 方法  68-70
    3.2.1 针对群体感应调控蛋白lasR和rhlR设计atsRNAs  68-70
    3.2.2 SRrhlR和SRlaR系列atsRNAs干扰载体连接并转化PAO1  70
  3.3 结果  70-75
    3.3.1 SRrhlR和SRlaR系列atsRNAs干扰载体连接鉴定  71
    3.3.2 SRrhlR系列atsRNAs对rhlR mRNA的影响  71-72
    3.3.3 SRrhlR系列atsRNAs对弹性蛋白酶LasB活性的影响  72
    3.3.4 SRrhlR系列atsRNAs对绿脓菌素表达的影响  72-73
    3.3.5 RT-PCR鉴定lasR mRNA的表达  73-74
    3.3.6 SRlaR系列atsRNAs对弹性蛋白酶LasB活性的影响  74
    3.3.7 SRlaR系列atsRNAs对绿脓菌素表达的影响  74-75
  3.4 讨论  75
4 总结与展望  75-76
参考文献  76-85
致谢  85-86
个人简历  86
在学期间发表的学术论文与研究成果  86

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