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瓜类细菌性果斑病菌hrcN基因的克隆及功能分析

作　者: 严婉荣
导　师: 戴良英; 赵廷昌
学　校: 湖南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 果斑病菌 Ⅲ型分泌系统 致病性 hrcN
分类号: S436.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


瓜类果斑病是种传性细菌病害,病原是西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。主要为害对象为葫芦科作物,对西瓜和甜瓜的危害较重,该病已在世界多个国家和我国多省发生,造成巨大经济损失。细菌的致病性与Ⅲ型分泌系统有密切关系,果斑病菌Ⅲ型分泌系统中hrcN基因的产物为ATPase,为某些通过Ⅲ型分泌系统分泌的蛋白转运提供能量,这些分泌蛋白往往与致病性有很大关系。通过比对发现果斑病菌中的hrcN基因与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、欧文氏杆菌(Erwinia tasmaniensis)、青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)以及水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)中的hrcN基因具有较高的相似性,相似性分别为58.57%、55.55%、71.14%、68.26%。根据NCBI上提供的果斑病菌hrcN基因序列,设计引物克隆了该基因。运用同源重组双交换的方法构建了该基因的突变菌株,PCR方法和Southern blot验证突变菌株。对突变体做了致病性、过敏性、群体感应(quorum sensing, QS)、生长曲线、运动性,胞外多糖和生物膜测定。结果显示：与野生型相比,突变体致病力和过敏性反应明显减弱,致病时间延迟,群体感应信号减弱,生长能力明显下降,运动性也没有野生型的强,胞外多糖的分泌差异不显著,生物膜的形成能力稍有加强。说明hrcN基因能够调控细菌的致病性。互补菌株只能恢复部分功能。为了了解hrcN基因与其他基因之间的调控关系,Real-Time qPCR定量检测Ⅲ型分泌系统中与致病性有关的3个基因(hrpA、hrcV、hrcU)及群体感应系统中的2个基因(LuxI、 LuxR),检测各个基因的表达量,结果显示：所选取的5个基因在突变体中的表达量均上调,hrcN基因与各基因间均为负调控关系。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 绪论  10-21
  1 瓜类细菌性果斑病菌  10-12
    1.1 病原及发病症状  10-12
    1.2 侵染循环及防治  12
  2 细菌分泌系统  12-18
    2.1 Ⅲ型分泌系统简述  15-17
      2.1.1 Ⅲ型分泌系统hrp基因  15-16
      2.1.2 Ⅲ型效应子及分子伴侣  16-17
    2.2 果斑病菌Ⅲ型分泌系统  17-18
    2.3 hrcN基因  18
  3 本研究的目的意义及技术路线  18-21
    3.1 研究目的及意义  18-20
    3.2 技术路线  20-21
第二章 hrcN基因的分子克隆及功能分析  21-40
  1 实验材料  21-23
    1.1 供试菌株  21-22
    1.2 生化试剂及仪器  22-23
    1.3 培养基  23
  2 实验方法  23-31
    2.1 Aac5基因组DNA的制备  23-24
    2.2 hrcN基因的扩增  24
    2.3 hrcN基因的纯化  24-25
    2.4 hrcN基因与pMD18-T Vector连接与转化  25
    2.5 重组质粒的快速筛选  25-26
    2.6 质粒DNA的提取及酶切  26-27
    2.7 庆大霉素抗性基因Gm的构建  27
    2.8 pK18mobsacB、hrcN-T、Gm-T的连接与转化  27
    2.9 hrcN基因突变体的构建  27-28
    2.10 hrcN基因突变体的验证  28-29
      2.10.1 PCR方法验证突变体  28
      2.10.2 Southern blot验证突变体  28-29
    2.11 ΔhrcN互补菌株的构建及验证  29-30
    2.12 致病性和过敏性测定  30
    2.13 群体感应信号测定  30
    2.14 生长曲线测定  30
    2.15 运动性测定  30
    2.16 胞外多糖检测  30-31
    2.17 生物膜测定  31
  3 结果与分析  31-39
    3.1 hrcN基因的克隆  31
    3.2 重组质粒的构建  31-32
    3.3 hrcN基因突变体菌株构建  32-33
    3.4 Southern杂交验证突变体  33-34
    3.5 hrcN基因的互补菌株构建  34-35
    3.6 致病性测定  35-36
    3.7 群体感应测定  36-37
    3.8 生长曲线测定  37
    3.9 运动性测定  37-38
    3.10 胞外多糖测定  38
    3.11 生物膜测定  38-39
  4. 小结与讨论  39-40
第三章 hrcN基因对相关基因表达量的影响  40-47
  1 实验材料  40-41
    1.1 供试菌株  40
    1.2 生化试剂及仪器  40-41
  2 实验方法  41-44
    2.1 相关基因实时定量PCR引物设计  41-42
    2.2 细菌总RNA的提取  42
    2.3 RNA反转录合成第一链cDNA  42-43
    2.4 建立Real-Time PCR反应体系  43
    2.5 相对定量方法  43-44
  3 结果与分析  44-46
    3.1 PCR检测引物特异性  44
    3.2 细菌总RNA的提取  44
    3.3 ΔhrcN中相关基因的表达  44-46
  4 小结与讨论  46-47
第四章 全文结论与讨论  47-49
  1 全文结论  47
  2 讨论  47-49
参考文献  49-53
附录1  53-54
附录2  54-55
致谢  55-56
作者简历  56

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 瓜果病虫害
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