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苏云金芽胞杆菌转录调控因子CodY的靶基因研究

作　者: 梅菲
导　师: 李明顺
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 苏云金芽胞杆菌 CodY Pull down 细菌单杂交
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

苏云金芽胞杆菌是一种低GC含量,既能产生芽胞又能产生杀虫晶体蛋白的革兰氏阳性细菌,在自然界中分布范围广。芽胞形成和杀虫晶体蛋白的调控机制一直是苏云金芽胞杆菌的研究热点。目前,人们对芽胞形成的机制有了比较深入的了解,对杀虫晶体蛋白的形成机制也有了一定的认识,但是关于Cry2类杀虫晶体蛋白代谢的调控机制研究仍不完善。转录调控蛋白CodY在低GC含量的革兰氏阳性菌中具有全局性的转录调控作用,在枯草芽胞杆菌中可调控超过200个基因的表达,这些基因与细胞感受态的形成、物质代谢、能量代谢以及病原微生物的毒力都有相关性。CodY蛋白在模式菌株枯草芽胞杆菌中的研究比较透彻,但在苏云金芽胞杆菌中则几乎是个空白。本实验室之前研究表明：CodY蛋白过表达能够引起苏云金芽胞杆菌YBT-881沉默的杀虫晶体蛋白基因cry2Ac4的表达,因此,CodY在杀虫晶体蛋白的形成过程中扮演着极其重要的作用。本研究在苏云金芽胞杆菌YBT-1520全基因组测序完成的基础之上,寻找与鉴定CodY蛋白作用的靶基因,从而为杀虫晶体蛋白形成的机制作进一步的补充,并为构建苏云金芽胞杆菌的代谢调控网络打下一定的基础。1.根据已经测得的YBT-1520全基因序列,我们对codY基因进行了生物信息学分析,Blast分析表明它与腊状芽胞杆菌的核苷酸序列相似性在99%以上,但相对于模式菌株枯草芽胞杆菌而言,相似性只有75%左右,序列相似性差异还是比较大的。另外,我们还对codY基因在YBT-1520中的位置进行了生物信息学的分析与预测,发现codY基因位于一个由7个ORF组成的操纵子中。2.本实验通过构建一种体外的Pull down方法在YBT-1520全基因组范围内寻找CodY蛋白调控的靶基因,用生物素-链霉亲和素系统亲和纯化与靶基因结合的CodY蛋白,ELISA和Western blot实验证明CodY-Ap蛋白能在体外生物素化,表明构建的该方法是可行的。3.通过生物素pull down的方法我们分析得到46种CodY蛋白直接作用的靶基因,分类后,发现这些靶基因涉及物质运输、代谢、环境信号的感知、遗传信息的传递等。我们选取5种可能与晶体蛋白形成相关的基因片段作进一步的验证,这其中既有位于启动子区域的DNA片段,也有位于基因内部的DNA片段。应用细菌单杂交系统进行验证,结果表明其中4种基因ilvB, oppA, yhfE, luxS与CodY蛋白有相互作用,这些基因与氨基酸转运、蛋白降解、支链氨基酸合成等相关,进而会影响杀虫晶体蛋白的形成。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略语表  11-12
1 前言  12-28
  1.1 苏云金芽胞杆菌  12-17
    1.1.1 苏云金芽胞杆菌生物学性质  12-13
    1.1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类  13-14
    1.1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的表达与调控  14-17
      1.1.3.1 转录水平的调控  15-16
      1.1.3.2 转录后水平的调控  16
      1.1.3.3 翻译水平的调控  16-17
    1.1.4 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的应用  17
    1.1.5 苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520  17
  1.2 芽胞杆菌属中全局性转录因子  17-23
    1.2.1 CcpA(分解代谢物控制蛋白)  17-18
    1.2.2 TnrA(氮代谢调控蛋白)  18-19
    1.2.3 CodY(全局性调控蛋白)  19-23
      1.2.3.1 CodY的结构  19-20
      1.2.3.2 CodY蛋白的效应物分子  20-21
      1.2.3.3 CodY结合热点  21-22
      1.2.3.4 CodY的功能  22-23
  1.3 转录因子与DNA相互作用的研究技术  23-26
    1.3.1 染色质免疫共沉淀(ChIP)  24
    1.3.2 Pull down技术  24
    1.3.3 酵母单杂交系统  24-25
    1.3.4 细菌单杂交系统  25-26
    1.3.5 凝胶阻滞实验(EMSA)  26
  1.4 Avi-tag  26-27
  1.5 本实验研究的目的与意义  27-28
2 材料与方法  28-39
  2.1 实验材料  28-30
    2.1.1 菌株、质粒与引物  28-29
    2.1.2 培养基的配制及主要成分  29-30
    2.1.3 抗生素使用浓度  30
  2.2 实验试剂和仪器  30-33
    2.2.1 常用试剂  30-31
    2.2.2 常用缓冲液及溶液  31-33
      2.2.2.1 质粒总DNA抽提及感受态制备所需试剂  31
      2.2.2.2 蛋白表达纯化及蛋白含量的测定相关试剂  31-32
      2.2.2.3 SDS-PAGE所需试剂  32
      2.2.2.4 Western blot相关试剂  32-33
      2.2.2.5 酶联免疫吸附测定(ELISA)  33
      2.2.2.6 生物素-链霉亲和素系统筛选CodY靶基因  33
    2.2.3 常用仪器  33
  2.3 实验方法  33-39
    2.3.1 质粒与总DNA的抽提  33-35
      2.3.1.1 大肠杆菌质粒的抽提  33-34
      2.3.1.2 苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提  34-35
    2.3.2 体外分子克隆实验操作  35-36
      2.3.2.1 PCR扩增  35
      2.3.2.2 连接体系  35-36
      2.3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化  36
    2.3.3 蛋白表达纯化  36-37
    2.3.4 SDS-PAGE  37
    2.3.5 Western blot  37-38
    2.3.6 酶联免疫吸附测定(ELISA)  38
    2.3.7 生物素-链霉亲和素系统筛选CodY靶基因  38-39
3 结果与分析  39-63
  3.1 苏云金芽胞杆菌中codY基因的生物信息学分析  39-40
  3.2 体外生物素pull down实验方法的构建与验证  40-49
    3.2.1 CodY生物素受体蛋白表达载体的构建与验证  40-42
    3.2.2 CodY生物素受体蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化  42-43
    3.2.3 生物素连接酶BirA的表达及纯化  43-44
    3.2.4 CodY蛋白体外生物素化与验证  44-48
      3.2.4.1 生物素化实验  44-45
      3.2.4.2 ELISA实验检测  45-47
      3.2.4.3 Western blot实验验证  47-48
    3.2.5 生物素pull down预实验  48-49
  3.3 生物素pull down寻找CodY靶基因  49-52
    3.3.1 连接有接头序列的YBT-1520基因组片段的制备  49-50
    3.3.2 生物素-链霉亲和素系统筛选CodY调控的靶基因  50-52
  3.4 CodY蛋白靶基因的确定与分析  52-58
  3.5 筛选得到的CodY蛋白靶基因的验证  58-63
    3.5.1 CodY蛋白靶基因的细菌单杂交验证  59-63
      3.5.1.1 CodY蛋白单杂交体系的构建  59-63
4 讨论  63-66
  4.1 CodY蛋白的调控机制  63
  4.2 全基因组范围内研究CodY蛋白的直接作用靶基因  63-64
  4.3 CodY蛋白结合的保守序列  64
  4.4 苏云金芽胞杆菌中CodY靶基因结果分析  64-65
  4.5 本实验的创新之处  65
  4.6 下一步研究展望  65-66
参考文献  66-71
致谢  71-72
附录  72

苏云金芽胞杆菌转录调控因子CodY的靶基因研究

内容摘要

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