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苏云金芽胞杆菌gab基因簇表达与调控的研究

作　者: 王维
导　师: 高继国
学　校: 东北农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苏云金芽胞杆菌 γ-氨基丁酸代谢旁路 γ-氨基丁酸 琥珀酸半醛 gab基因簇 sigL基因 杀虫晶体蛋白
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是农业生物防治领域中应用最为广泛的杀虫微生物。Bt不同于其它芽胞杆菌的最大特点是,Bt在形成芽胞的同时,还能产生具有高效杀虫活性的伴胞晶体蛋白。γ-氨基丁酸旁路(γ-aminobutyric acid,GABA;GABA shunt)广泛存在于生物体内,Bt中GABA shunt相关的gab基因簇中的gabT基因和gabD基因分别编码的γ-氨基丁酸转氨酶(GABA transaminase,GABASE)和琥珀酸半醛脱氢酶(Succinic semialdhyde dehydrogenase,SSADH),分别催化GABA生成琥珀酸半醛(Succinic semialdhyde,SSA)和SSA生成琥珀酸,进入三羧酸循环。本研究所在课题组前期发现Bt中gab基因簇受σL因子控制,并受该基因簇调控基因gabR编码产物GabR蛋白正调控。其GABA shunt产物对于Bt中gab基因簇的转录影响目前尚无报道。本文主要围绕GABA shunt核心产物GABA和SSA对Bt中gab基因簇转录的影响及其机制,以及GABA shunt阻断和σL因子对芽胞和晶体产生的影响进行列研究。通过β-半乳糖苷酶活性分析表明,GABA和SSA均能明显诱导gabT基因启动子的转录活性,其中SSA的诱导现象比GABA更加明显。而无论是GABA还是SSA均无法诱导gabR基因启动子和sigL基因启动子的转录活性。分别在gabT、gabR、gabD和sigL四种突变体HD(△gabT)、HD(△gabR)、HD(△gabD)和HD(△sigL)中转入gabT基因启动子与lacZ的融合表达质粒,在培养基中分别加入GABA和SSA分析各突变体中β-半乳糖苷酶活性,结果表明,加入GABA时在HD(△gabT)、HD(△gabD)中gabT基因启动子的转录活性均高于出发菌株HD73;而加入琥珀酸半醛时HD(△gabD)中gabT基因启动子的转录活性明显高于HD73和HD(△gabT)中gabT基因启动子的转录活性,上述结果说明了菌体内GABA和SSA的积累对于gabT基因启动子的转录活性的诱导作用。同时结果显示GABA和SSA对于HD(△gabR)和HD(△sigL)中gabT基因启动子转录活性的诱导作用完全丧失,证明了这种诱导活性也是受σL因子控制,并且受GabR正调控。通过RT-PCR的结果表明,gabT基因和gabD基因在加入GABA和SSA时是共转录的,通过5’RACE方法确定了gabT基因的转录起始位点。对苏云金芽胞杆菌HD73菌株中克隆了gabR和sigL基因进行了原核表达。通过pET-21b和pGEX-4T-1载体分别构建了这两种基因的表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(de3)菌株中,SDS-PAGE显示这两个基因都分别得到了表达,其中得到了GabR的纯化蛋白。为进一步研究gab基因簇的分子调控机制奠定了基础。另一方面本研究在获得苏云金芽胞杆菌HD-73菌株和突变菌株的基础上,分析了GABA shunt阻断和sigL基因功能缺失对Bt生长能力和产芽孢能力的影响。结果表明,GABA shunt阻断对Bt的生长和产晶体蛋白能力没有明显的影响,却造成了Bt产芽胞能力的下降,说明GABA shunt与Bt芽胞形成有一定的关系。而生长曲线结果表明,在营养相对贫瘠的SM培养基中HD73与HD(△sigL)的生长差异不大,但在营养丰富的LB培养基中可以观察到两者的显著差异。SDS-PAGE分析结果表明了sigL基因功能缺失明显降低了Cry蛋白的产量,而β-半乳糖苷酶活性分析证明了这种表达量的差异并不是转录水平上造成的。以上结果证明了sigL基因功能缺失以及其所调控的某些些代谢途径与Bt生长和芽胞及晶体蛋白的产量有密切关系。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-25
  1.1 苏云金芽胞杆菌概述  13-14
    1.1.1 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的分类  13-14
    1.1.2 苏云金芽胞杆菌cry 基因的表达调控  14
  1.2 代谢途径对苏云金芽胞杆菌芽胞与晶体蛋白形成影响  14-15
  1.3 γ-氨基丁酸代谢旁路 的学位论文">γ-氨基丁酸代谢旁路的研究进展  15-22
    1.3.1 γ-氨基丁酸代谢旁路的基本性质  17-18
    1.3.2 细菌中参与γ-氨基丁酸代谢旁路的相关基因簇  18-20
    1.3.3 γ-氨基丁酸和琥珀酸半醛在基因调控中的研究进展  20-22
  1.4 Sigma54 因子在原核生物中的研究进展  22-23
    1.4.1 Sigma54 因子的作用机制  23
    1.4.2 Sigma54 因子对细菌基因调控的研究  23
  1.5 立题依据与目的意义  23-25
    1.5.1 立题依据  23-24
    1.5.2 目的意义  24-25
2 实验材料与方法  25-43
  2.1 实验材料与方法  25-29
    2.1.1 菌株与质粒  25-27
    2.1.2 抗生素与培养基  27
    2.1.3 酶与生化试剂  27-28
    2.1.4 溶液与缓冲液  28-29
  2.2 仪器设备  29-30
  2.3 实验研究方法  30-43
    2.3.1 Bt 总DNA 的提取  30
    2.3.2 目的基因PCR 扩增  30-32
    2.3.3 TRIzol 法提取Bt 总RNA  32
    2.3.4 RNA 纯化  32-33
    2.3.5 cDNA 的合成  33
    2.3.6 RT-PCR  33
    2.3.7 荧光定量PCR  33-34
    2.3.8 SMARTerTM RACE  34-36
    2.3.9 琼脂糖凝胶电泳  36
    2.3.10 酶切反应  36
    2.3.11 DNA 的回收  36-37
    2.3.12 DNA 片段的连接  37
    2.3.13 大肠杆菌JM109 热激感受态细胞制备  37
    2.3.14 大肠杆菌的热激转化  37
    2.3.15 大肠杆菌SCS110 电击感受态细胞制备  37
    2.3.16 大肠杆菌电击转化方法  37-38
    2.3.17 Bt 电击感受态细胞制备  38
    2.3.18 Bt 菌株的电击转化  38
    2.3.19 重组质粒的提取  38-39
    2.3.20 重组质粒的鉴定  39
    2.3.21 基因序列的测定及分析  39-40
    2.3.22 细胞培养和诱导表达  40
    2.3.23 目的蛋白的镍柱纯化  40-41
    2.3.24 少量Bt 蛋白的检测  41
    2.3.25 SDS-PAGE 电泳  41
    2.3.26 测定Bt 菌株生长曲线  41
    2.3.27 活芽胞记数  41
    2.3.28 β-半乳糖苷酶酶活分析  41-43
3 结果与分析  43-68
  3.1 GABA 和SSA 对Bt 中gab 基因簇转录活性的影响  43-49
    3.1.1 GABA 和SSA 对gabT 启动子的诱导作用  43-44
    3.1.2 GABA 和SSA 对突变体中gabT 启动子的诱导作用  44-46
    3.1.3 GABA 和SSA 对gabR 启动子的转录活性的影响  46-49
  3.2 GABA 和SSA 对Bt 中sigL 基因转录活性的影响  49-51
    3.2.1 sigL 基因启动子与lacZ 融合表达质粒的构建与活性分析  49-51
    3.2.2 GABA 和SSA 对sigL 基因启动子的转录活性的影响  51
  3.3 Bt 中gab 基因簇转录情况的分析  51-54
    3.3.1 gab 基因簇转录起始位点的分析  51-52
    3.3.2 gab 基因簇在诱导条件下的RT-PCR 分析  52-54
  3.4 σL 和GabR 蛋白的表达纯化  54-60
    3.4.1 sigL 基因与pGEX-4T-1 表达质粒的构建与表达  54-55
    3.4.2 gabR 基因与pGEX-4T-1、pET-21b 表达质粒的构建与表达  55-59
    3.4.3 GabR 蛋白的纯化  59-60
  3.5 GABA 旁路阻断对Bt 芽胞与晶体蛋白产量的影响  60-62
    3.5.1 gab 基因簇基因缺失对菌株生长的影响  60-61
    3.5.2 gab 基因簇基因缺失对菌株产生活芽胞数的影响  61
    3.5.3 gab 基因簇基因缺失对晶体蛋白产量的影响  61-62
  3.6 sigL 基因缺失对Bt 芽胞与晶体蛋白产量的影响  62-68
    3.6.1 sigL 基因缺失对Bt 菌株生长的影响  62-63
    3.6.2 sigL 基因缺失对Bt 菌株芽胞产量的影响  63-64
    3.6.3 HD73 和HD(△sigL)在不同氮源培养基中晶体蛋白的差异  64
    3.6.4 HD73 和HD(△sigL)中cry1Ac 基因转录活性的分析  64-68
4 讨论  68-71
  4.1 GABA 和SSA 对Bt 中gab 基因簇转录的诱导  68
  4.2 GABA 旁路阻断对Bt 的影响  68-69
  4.3 sigL 基因对Bt 生长代谢及晶体蛋白的重要性  69
  4.4 下一步工作展望  69-71
5 结论  71-72
致谢  72-73
参考文献  73-80
攻读硕士学位期间发表的学术论文  80

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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