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阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶脑部植入剂的研究

作　者: 齐娜
导　师: 唐星
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药剂学
关键词: 阿糖胞苷 囊泡型磷脂凝胶 流变学 体外释放 缓释 灭菌 胶质瘤 脑内分布 脑内植入 C6/U87-MG胶质瘤株
分类号: R943
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


脑胶质瘤发病率高,手术难以完全切除,需要术后化疗,但传统的给药方式很难使高浓度药物到达肿瘤部位,具有高死亡率及高原位复发率的特点。本研究首次将阿糖胞苷制成囊泡型磷脂凝胶,作为术后局部缓释化疗制剂用于脑胶质瘤综合治疗,其优势在于：该制剂具有缓慢释放的特性,长时间作用于肿瘤细胞达到抑制肿瘤复发的作用；成功避开血脑屏障,使较高浓度的药物直接作用于肿瘤切除部位,有效杀灭残存的肿瘤细胞；磷脂作为其主要载体材料具有较好的生物相容性,且无毒性。在处方前研究中,建立了阿糖胞苷(Ara-C)、磷脂及溶血磷脂的体外含量测定方法。Ara-C在不同水性介质中的溶解度均大于452.7mg/ml,油水分配系数小,亲脂性弱,随着pH的增加而降低；其脂质体／水分配系数为2.51±0.53,推测该药具有较好的细胞膜亲和力。从制剂的外观、粒径、包封率、体外释放、流变学等方面研究了阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶(Ara-C VPGs)的性质及灭菌稳定性。透射电镜观察,其分散后的结构大多数为小单层脂质体；冷冻蚀刻电镜观察凝胶内部真实结构为相邻囊泡紧密堆积形成了独特的三维网状立体结构,在结构上区别于脂质体和脂质体凝胶。作为载体材料的磷脂浓度分别为300、400、500mg/g时,Ara-C VPGs的包封率分别为31.65%、53.99%、72.12%,432h体外累计释药分别为48.93%、37.37%、23.22%。此结果表明在水相体积不变时,随着磷脂浓度的增加,包封的体积增大而使得包封率升高；体外释放明显减慢,其原因为磷脂浓度增加,使粘度明显增大,减慢囊泡之间和囊泡内的药物向释放介质的扩散过程,结果释放明显减慢。通过高压均质法制备的Ara-C VPGs,经pH7.4的PBS再分散后粒径和包封率分别由灭菌前的119.6±66.2nm、32.6±2.1%灭菌后增加到165.6±71.9nm、62.6±2.3%,推测可能的原因是囊泡融合使粒径增大,包封体积增加导致包封率增加。体外药物释放由灭菌前80h累积释放79.13%,灭菌后降低至432h累积释放74.76%;在流变学研究中,灭菌后粘弹性加强,流动性降低。粘度的变化与粒径的分布密切相关,多分散系数越大粘度越低,由于小粒径囊泡类似于球珠可以润滑大粒径囊泡,从而降低体系粘度。灭菌后多分散系数比灭菌前小,因此,粘度增强,药物释放减慢。总之,经过高压灭菌后,Ara-C VPGs的囊泡粒径增大,包封率增加,体外释放缓慢,粘弹性加强,性质更加稳定。然而,0.05g Ara-C VPGs中药物含量灭菌前为1.01±0.04mg,灭菌后降低至0.73±0.06mg,溶血磷脂灭菌前为1.39±0.03%,灭菌后增加至2.32±0.01%。为了提高制剂中药物和磷脂的稳定性,尝试在处方中加入不同的稳定剂。研究发现加入亚硫酸钠能同时增加阿糖胞苷和磷脂的灭菌稳定性。推测其原因为灭菌的过程中亚硫酸钠电子转移产生SO3-·,通过自由基的反应能大大的缩减HO·的产生,抑制了Ara-C和磷脂的降解。改变囊泡的表面电荷结构,通过与聚合物静电吸附,形成具有特殊性质的囊泡,可以改变其体内外性质。对于聚谷氨酸吸附-十八胺修饰复合型VPGs (OCA-PGlu VPGs)和聚赖氨酸吸附-胆固醇硫酸钠修饰复合型VPGs(CHss-PLys VPGs),从透射电镜观察可以看出在囊泡的表面包上一层衣膜,粒径在100～200nm,衣膜厚度约为10nm; zeta电位与采用E80磷脂制备的VPGs是一致的,推测PGlu和PLys通过静电作用分别吸附含OCA和CHss的VPGs的囊泡表面。体外释放研究Ara-C VPGs、OCA-PGlu VPGs和CHss-PLys VPGs432h累积释放分别为37.37%、45.65%、47.03%；在流变学研究中,CHss-PLys VPGs和OCA-PGlu VPGs粘弹性较Ara-C VPGs明显加强,推测聚氨基酸的链段以网状交织在囊泡的周围,在应变力作用下,形变量明显变大,其中弹性模量和粘性模量随着角频率变化的曲线形状没有改变,这个曲线非常接近福格特模型的蠕变现象。尽管粘弹性明显加强,但是药物释放反而加快,因此,从增加粘度的角度而减慢药物的释放是解释不通的。然而,推测其原因为在37℃囊泡膜上的磷脂分子具有流动性,聚电解质增加膜的渗透性,导致药物释放加快。以SD大鼠为动物模型,通过脑内局部定位给药,用UPLC-MS/MS法测定Ara-C VPGs大鼠脑内植入给药后在不同时间、不同区域脑组织中的药物浓度,研究该制剂中的药物在脑内的分布情况。结果显示,在脑内注射VPGs后28天,Ara-C浓度在距离植入部位5mm范围内仍然能高于0.1μg/ml的治疗浓度,表明Ara-C VPGs在脑内有明显的缓释效应。脑组织是不规则的球体,具有流动性的Ara-C VPGs在脑内的分布不同于其他的固体植入剂在脑组织中的扩散过程,这个过程可能为Ara-C VPGs逐渐被脑脊液稀释成无数的囊泡并随着脑脊液循环进入侧脑室,沿着侧脑室的边缘及侧脑室的脉络丛向脑组织深部扩散。由于脑脊液中有丰富的磷脂酶,VPGs中的磷脂最终在脑内被磷脂酶降解,而药物在脑脊液中被代谢。荧光显微镜观察验证药物在脑内转运过程及分布情况。安全性研究中,VPGs在植入正常大鼠脑内第3、7天后,对脑组织切片HE染色观察,发现出现轻度的脑水肿和少量的炎性细胞的浸润,未见脑组织坏死,局部反应轻微,安全性相对较高。体外细胞实验结果表明该制剂对C6和U87-MG胶质瘤细胞均有较明显的体外抑瘤效应,呈剂量依赖性,其中OCA-PGlu VPGs组抑制细胞生长作用最强,与荧光显微镜观察体外细胞摄取情况是一致的；对鼠C6胶质瘤细胞抑制效应优于人U87-MG胶质瘤细胞。体内抑瘤实验结果表明：与空白VPGs组相比,Ara-C VPGs对皮下C6鼠胶质瘤有较明显的抑制效应,抑瘤率达到95.87%(p<0.01),明显强于对照组溶液剂的抑瘤率45.52%(p>0.05)；而对于U87-MG裸鼠皮下移植瘤动物模型,与空白VPGs组相比,在相同剂量下,各VPGs组均有明显的肿瘤抑制作用(p<0.01),顺序为OCA-PGlu VPGs组(抑瘤率为36.82%)>Ara-C VPGs组(抑瘤率为34.93%)>CHss-PLys VPGs组(抑瘤率为28.58%),Ara-C溶液抑瘤率为16.02%,无明显抑制作用(p>0.01),与体外细胞抑制效应及细胞摄取情况的结果是一致的。其原因一方面是具有促渗透作用的PGlu和PLys能促进药物进入肿瘤细胞,另一方面是当OCA-PGlu VPGs与肿瘤细胞接触时,由于聚氨基酸被蛋白酶降解,暴露了囊泡表面OCA的正电荷,与带负电的肿瘤细胞膜之间通过静电的作用,增加细胞的摄取；然而对于CHss-PLys VPGs,囊泡表面的聚氨基酸被蛋白酶降解,暴露囊泡表面CHss的负电荷与带负电性的肿瘤细胞相互排斥,不被细胞摄取；每组动物体重变化均较小,毒性均较低。研究显示Ara-C VPGs能提高肿瘤部位的药物浓度,延长抗肿瘤药物与肿瘤细胞的接触时间,改善阿糖胞苷的脑内分布行为和抗肿瘤疗效。其性质稳定,安全有效,适于脑内植入给药,为阿糖胞苷脑部缓释给药系统的研究提供科学的依据。

全文目录


中文摘要  12-15
ABSTRACT  15-20
前言  20-30
  参考文献  27-30
第一章 处方前研究  30-44
  1. 仪器和材料  30
    1.1 仪器  30
    1.2 材料  30
  2. 方法和结果  30-42
    2.1 阿糖胞苷体外分析方法  30-34
      2.1.1 检测波长  30-31
      2.1.2 色谱条件  31
      2.1.3 方法专属性  31-32
      2.1.4 标准曲线  32
      2.1.5 检测限与定量限  32-33
      2.1.6 精密度  33
      2.1.7 重复性  33
      2.1.8 稳定性  33
      2.1.9 回收率  33-34
      2.1.10 样品含量测定  34
    2.2 磷脂体外分析方法  34-36
      2.2.1 标准曲线  35
      2.2.2 精密度  35-36
      2.2.3 回收率  36
      2.2.4 磷脂含量测定  36
    2.3 溶血磷脂体外分析方法  36-39
      2.3.1 色谱条件  37
      2.3.2 方法专属性  37-38
      2.3.3 标准曲线  38
      2.3.4 精密度  38-39
      2.3.5 回收率  39
    2.4 阿糖胞苷基本理化性质的研究  39-42
      2.4.1 阿糖胞苷在不同介质中的溶解度  39-40
      2.4.2 阿糖胞苷在不同pH中油/水分配系数  40-41
      2.4.3 阿糖胞苷脂质体/水分配系数  41-42
  3. 讨论  42
  4. 本章小结  42-43
  参考文献  43-44
第二章 阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶的制备、表征 及灭菌稳定性研究  44-71
  一、阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶的制备和表征  44-58
    1. 仪器和材料  44-45
      1.1 仪器  44
      1.2 材料  44-45
    2. 方法  45-47
      2.1 阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶的制备  45
        2.1.1 高压均质法  45
        2.1.2 不对称离心法  45
      2.2 形态观察  45-46
        2.2.1 透射电镜  45
        2.2.2 冷冻蚀刻电镜  45-46
      2.3 包封率的测定  46
      2.4 粒径的测定  46
      2.5 体外释放测定  46-47
        2.5.1 平衡透析法  46
        2.5.2 扩散池法  46-47
    3. 结果与讨论  47-58
      3.1 形态观察  47-48
      3.2 包封率影响因素考察  48-50
      3.3 制备方法考察  50-52
      3.4 处方因素的考察  52-56
        3.4.1 分散介质pH的影响  52-53
        3.4.2 磷脂种类的影响  53
        3.4.3 药物浓度的影响  53
        3.4.4 磷脂浓度的影响  53-55
        3.4.5 磷脂/胆固醇比例的影响  55-56
      3.5 体外释放方法考察  56-58
  二、阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶的灭菌稳定性研究  58-68
    1. 仪器和材料  58-59
      1.1 仪器  58
      1.2 材料  58-59
    2. 方法  59-61
      2.1 阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶的制备  59
      2.2 形态的观察  59
      2.3 包封率  59
      2.4 粒径及zeta电位的测定  59
      2.5 体外释放  59-60
      2.6 流变学性质  60
      2.7 灭菌的稳定性  60-61
        2.7.1 磷脂氧化指数的测定  60
        2.7.2 溶血磷脂的测定  60
        2.7.3 体外红细胞溶血实验  60-61
    3. 结果和讨论  61-68
      3.1 透射电镜下形态  61-62
      3.2 粒径、zeta电位和包封率  62-63
      3.3 体外释放  63
      3.4 流变特性  63-65
      3.5 灭菌的稳定性  65-68
        3.5.1 药物的稳定性  65-66
        3.5.2 磷脂氧化  66
        3.5.3 磷脂水解  66-67
        3.5.4 体外红细胞溶血  67-68
    4. 本章小结  68
  参考文献  68-71
第三章 聚氨基酸吸附-电荷修饰复合型VPGs的设计与评价  71-80
  1. 仪器和材料  71-72
    1.1 仪器  71-72
    1.2 材料  72
  2. 方法  72-74
    2.1 聚氨基酸吸附-电荷修饰复合型VPGs的制备  72-73
    2.2 形态的观察  73
      2.2.1 透射电镜  73
      2.2.2 光学显微镜  73
    2.3 包封率  73
    2.4 粒径及zeta电位的测定  73
      2.4.1 粒径测定  73
      2.4.2 zeta电位的测定  73
    2.5 体外释放测定  73-74
    2.6 流变学性质的测定  74
  3. 结果和讨论  74-79
    3.1 透射电镜下形态  74-75
    3.2 粒径、zeta电位和包封率  75-76
    3.3 体外释放  76-77
    3.4 流变特性  77-78
    3.5 光学显微镜下形态验证  78-79
  4. 本章小结  79
  参考文献  79-80
第四章 阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶大鼠脑内分布 及安全性研究  80-91
  1. 仪器与材料  80-81
    1.1 仪器  80-81
    1.2 材料  81
    1.3 动物  81
  2. 方法  81-85
    2.1 脑内药物植入  81-82
    2.2 脑组织及血浆样品的采集、处理  82-83
      2.2.1 血浆样品的处理  82-83
      2.2.2 组织样品的处理  83
    2.3 脑组织及血浆样品中药物的测定  83-85
      2.3.1 色谱及质谱条件  83
      2.3.2 方法学验证  83-85
    2.4 脑内荧光成像的观察  85
    2.5 制剂安全性研究  85
  3. 结果与讨论  85-90
    3.1 阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶在脑组织内的药物分布  85-87
    3.2 阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶外周血浆中的药物浓度  87
    3.3 脑内荧光成像的观察  87-89
    3.4 脑组织的安全性  89-90
  4. 本章小结  90
  参考文献  90-91
第五章 阿糖胞苷囊泡型磷脂凝胶治疗胶质瘤药效学研究  91-111
  1. 仪器与材料  91
    1.1 仪器  91
    1.2 材料  91
  2. 方法  91-95
    2.1 Ara-C VPGs体外抑制肿瘤细胞生长实验  91-93
      2.1.1 C6及U87-MG细胞的复苏与培养  91-92
      2.1.2 分组及加药  92
      2.1.3 细胞生存率和细胞生长抑制率  92
      2.1.4 荧光显微镜观察细胞摄取  92-93
    2.2 Ara-c VPGs对大鼠C6胶质瘤抑制作用  93-94
      2.2.1 胶质瘤皮下模型的建立  93
      2.2.2 实验动物分组及给药方案  93
      2.2.3 观察指标  93-94
    2.3 Ara-c VPGs对裸鼠U87-MG胶质瘤抑制作用  94-95
      2.3.1 胶质瘤皮下模型的建立  94
      2.3.2 实验动物分组及给药方案  94
      2.3.3 观察指标  94-95
  3. 结果与讨论  95-109
    3.1 细胞毒性实验结果  95-98
    3.2 荧光显微镜观察细胞摄取情况  98-102
    3.3 动物模型的建立  102
    3.4 皮下C6胶质瘤荷瘤大鼠体内抑瘤实验结果  102-105
      3.4.1 生长状态  102
      3.4.2 体重的变化  102-103
      3.4.3 瘤体积的变化  103-104
      3.4.4 肿瘤增殖率  104
      3.4.5 瘤重及抑瘤率  104-105
    3.5 皮下U87-MG胶质瘤荷瘤裸鼠体内抑瘤实验结果  105-109
      3.5.1 生长状态  105-106
      3.5.2 体重的变化  106
      3.5.3 瘤体积的变化  106-107
      3.5.4 肿瘤增殖率  107
      3.5.5 瘤重及抑瘤率  107-109
  4. 本章小结  109-110
  参考文献  110-111
全文结论  111-113
  本课题创新点  112-113
致谢  113-114
作者简介  114-115
附件  115-122

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药剂学 > 制剂学
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