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5-FU-N-琥珀酰壳聚糖纳米粒制备及肿瘤靶向性研究

作　者: 颜承云
导　师: 陈大为
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药剂学
关键词: N-琥珀酰壳聚糖 5-氟尿嘧啶 长循环纳米粒 体外释放 组织分布 肿瘤靶向性 药效学 药物动力学
分类号: R94
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


N-琥珀酰壳聚糖（N-succinyl-chitosans，Suc-Chi）是由壳聚糖和丁二酸酐反应合成的一种羧基酰化的水溶性壳聚糖衍生物。N—琥珀酰壳聚糖是一种两亲聚合物，具有较好的生物相溶性，较低的毒性、较长的体内半期及肿瘤亲和性。这些特性使其成为一种新型“隐形NPs”和“高肿瘤趋向性NPs”的较为理想载体材料。本文设计以N-琥珀酰壳聚糖为载体，5-氟尿嘧啶为抗肿瘤模型药，制备纳米粒（5-FU-Suc-Chi／NPs）。5-FU-Suc-Chi／NPs肿瘤靶向传递系统的研究结果，证实了5-FU-Suc-Chi／NPs具有长循环特性，并可以通过EPR效应及其对肿瘤的亲和力实现肿瘤靶向。本文研究的主要方法、内容和结论包括以下几个方面：1 N-肛琥珀酰壳聚糖的制备及结构表征：采用非均相法以二甲亚砜作为溶剂，合成N-琥珀酰壳聚糖，通过IR、1H NMR、13C NMR对产物进行结构确证。采用灰分分析法测定Suc-Chi样品取代度，并通过1H NMR法验证。2 N-琥珀酰壳聚糖理化性质及药用特性：N-琥珀酰壳聚糖是一种聚两性电解质，Suc-Chi（DS=0.33）在4.5～6.8 pH值范围内不溶，在pH 4.5以下和pH 6.8以上溶解性较好；Suc-Chi（DS=0.33）等电点（pI）为5.20，玻璃化温度（Tg）为304.16℃；Suc-Chi（DS=0.33）zata电位（ξ）随pH增大而降低，在pH约为5.0时zata电位等于零；Suc-Chi（DS=0.33）油／水分配系数(Papp)在pH 5.87达到最大值，Papp)0.16。采用凝胶渗透色谱法（GPC）法测定N-琥珀酰壳聚糖不同降解产物的分子量（Mw）。3 5-FU-Suc-Chi／NPs制备及工艺处方优化：采用乳化溶剂扩散法制备5-FU-Suc-Chi／NPs。建立纤维素酶降解法测定5-FU-Suc-Chi／NPs包封率的分析方法。以包封率、载药量、粒径为评价指标，在单因素实验基础上，按正交设计L9（34）表进行试验，优化处方。最优处方：5-FU初始浓度为1000μg／mL；乙醇与Span-80体积比为1∶4；Suc-Chi浓度为4mg／mL；超声时间为5 min。4 5-FU-Suc-Chi／NPs理化特征及体外释放行为：采用透射电镜和扫描电镜观察5-FU-Suc-Chi／NPs外观形态，激光粒度仪测定其粒径，结果表明5-FU-Suc-Chi／NPs外观平滑呈球形或类球形，形态比较均匀完整；分散性好，粒径分布窄，呈正态分布，其平均粒径为236.6±64.7 nm；zeta电位为-27.2±0.2 mv；包封率和载药量分别为62.36±0.74％和18.98±0.68％。采用透析袋法测定5-FU-Suc-Chi／NPs体外释药速度，在释药的初始阶段出现突释，1h药物释放达到45％，24小时达到67％，随后持续缓慢释放一直到第4d。5-FU注射液释药速度较快，1h基本释药完毕。两者体外释药存在显著差异（P＜0.05），说明5-FU-Suc-Chi／NPs有明显的缓释作用。5-FU-Suc-Chi／NPs释放速度随介质pH值升高而减慢。5-FU初始浓度与5-FU-Suc-Chi／NPs释药量之间不存在线性关系。采用Origin7.5软件拟合药物体外释药模型的研究表明，5-FU注射液的释放符合一级动力学方程，5-FU-Suc-Chi／NPs的释放较符合双指数双相动力学模型。5 5-FU-Suc-Chi／NPs的体内组织分布及靶向性：采用流式细胞仪检测荧光强度来评价FITC-Suc-Chi／NPs与K562白血病肿瘤细胞之间的亲和性。结果表明，FICT-Suc-Chi／NPs与FICT-CS／NPs对K562白血病肿瘤细胞都具有较高的亲和力，两者相比FICT-Suc-Chi／NPs的亲和力更强。建立FITC-Suc-Chi／NPs的体内荧光分析方法，检测空白Suc-Chi／NPs在Sarcoma180-荷瘤小鼠体内组织分布，并通过组织切片的荧光显微照片确证FICT-Suc-Chi／NPs的组织分布结果。研究发现，FICT-Suc-Chi／NPs能够长时间的滞留在血液中，在各组织及血浆中分布的数量次序依次为肾＞肿瘤＞血液＞肝＞脾＞肺。结果表明，FICT-Suc-Chi／NPs具有长循环特性和肿瘤靶向性。建立5-FU体内分析方法，评价5-FU-Suc-Chi／NPs在荷瘤小鼠体内靶向性。研究发现，5-FU-Suc-Chi／NPs中的5-FU能够在血中长时间的滞留，与5-FU原形药相比较具有明显的缓释作用。5-FU-Suc-Chi／NPs中的5-FU在荷瘤小鼠体内分布趋势为：1 h时，肝＞肿瘤＞血＞肾＞脾＞心＞肺；1d时，肿瘤＞肝＞脾＞肾＞血＞肺＞心；3d时，肿瘤＞肝＞肾＞脾＞血＞肺＞心。表明5-FU-Suc-Chi／NPs具有肿瘤靶向作用，可降低心脏、肾脏的毒副作用。肿瘤相对摄取率Re和峰浓度比Ce分别为：9.43±1.86，2.75±0.26，说明5-FU-Suc-Chi／NPs对肿瘤的趋向性大于5-FU注射液。6 5-FU-Suc-Chi／NPs的药动学及药效学：建立5-FU在大鼠血浆中分析方法，5-FU-Suc-Chi／NPs在大鼠体内动力学研究发现，5-FU-Suc-Chi／NPs与5-FU注射液的主要药物动力学参数之间存在显著性差异。5-FU-Suc-Chi／NPs的T1／2显著延长11.98倍，AUC显著增大3.5倍，MRT显著延长11.8倍，CL显著减小0.124倍；表明5-FU-Suc-Chi／NPs具有长循环特性，实现了药物的缓释作用。5-FU-Suc-Chi／NPs在Sarcoma 180-荷瘤小鼠体内药效学的研究表明，5-FU-Suc-Chi／NPs与5-FU注射液相比较，5-FU-Suc-Chi／NPs能够更有效地抑制Sarcoma 180肿瘤的生长，而且组织毒性较温和。

全文目录


中文摘要  14-16
英文摘要  16-19
前言  19-37
  一 增强渗透性和滞留性(ERP)效应  20-24
  二 “隐形”纳米粒传递系统  24-25
  三 N-琥珀酰壳聚糖作为纳米粒载体的选择  25-27
  四 抗肿瘤模型药的选择  27-28
  五 本文立题目的及意义  28-29
  参考文献  29-37
第一章 N-琥珀酰壳聚糖的制备及结构表征  37-47
  一 材料与仪器  37
    1 材料  37
    2 仪器  37
  二 方法与结果  37-43
    1 壳聚糖的降解  37-39
      1.1 壳聚糖粘均分子量的测定  38
      1.2 壳聚糖脱乙酰度D.D的测定  38-39
    2 N-琥珀酰壳聚糖的制备  39
      2.1 均相法合成N-琥珀酰壳聚糖  39
      2.2 非均相法合成N-琥珀酰壳聚糖  39
      2.3 N-琥珀酰壳聚糖合成路线  39
    3 N-琥珀酰壳聚糖取代度的测定  39-40
      3.1 灰化分析法测定N-琥珀酰壳聚糖取代度  39-40
      3.2 ~1HNMR法测定N-琥珀酰壳聚糖取代度  40
    4 N-琥珀酰壳聚糖结构表征  40-43
      4.1 合成产物红外扫描分析  40-41
      4.2 合成产物核磁共振扫描分析  41-43
  三 讨论与小结  43-44
    1 讨论  43-44
    2 小结  44
  参考文献  44-47
第二章 N-琥珀酰壳聚糖理化性质及药用特性  47-58
  一 材料与仪器  47
    1 材料  47
    2 仪器  47
  二 方法与结果  47-54
    1 检测波长的选择  47-48
    2 N-琥珀酰壳聚糖的溶解性能  48-49
      2.1 不同溶剂下的溶解性能测试  48
      2.2 不同pH值水中的溶解性测试  48-49
    3 等电点(pI)的测定  49-50
    4 zata电位(ζ)的测定  50-51
    5 玻璃化温度(Tg)的测定  51
    6 N-琥珀酰壳聚糖油/水分配系数(P_(app))的测定  51-53
      6.1 N-琥珀酰壳聚糖分析方法的建立  51-52
        6.1.1 检测波长的选择  52
        6.1.2 色谱条件  52
        6.1.3 标准曲线的绘制  52
      6.2 油/水分配系数的测定  52-53
    7 不同分子量N-琥珀酰壳聚糖的制备  53-54
      7.1 N-琥珀酰壳聚糖的降解  53
      7.2 GPC法测定N-琥珀酰壳聚糖的分子量  53-54
        7.2.1 色谱条件  53
        7.2.2 分子量测定方法  53-54
  三 讨论与小结  54-56
    1 讨论  54-56
    2 小结  56
  参考文献  56-58
第三章 5-FU-Suc-Chi/NPs制备及处方工艺优化  58-76
  一 材料与仪器  58
    1 材料  58
    2 仪器  58
  二 方法与结果  58-72
    1 5-FU外分析方法的建立  58-60
      1.1 最大吸收波长的选择  58-59
      1.2 色谱条件  59
      1.3 标准曲线  59
      1.4 精密度  59-60
      1.5 回收率  60
    2 5-FU基本性质的考察  60-61
      2.1 不同介质中平衡溶解度的测定  60-61
      2.2 溶液稳定性考察  61
    3 5-FU-Suc-Chi/NPs制备方法优化  61-64
      3.1 5-FU-Suc-Chi/NPs制备方法  61-62
        3.1.1 乳化交联法  61-62
        3.1.2 离子交联法  62
        3.1.3 乳化溶剂扩散法  62
      3.2 Suc-Chi/NPs外观及粒径的评价  62-63
      3.3 5-FU-Suc-Chi/NPs包封率评价  63-64
    4 5-FU-Suc-Chi/NPs包封率测定方法的建立  64-66
      4.1 测定药物包封率的介质的筛选  64
      4.2 纤维素酶降解法测定5-FU-Suc-Chi/NPs包封率  64-66
        4.2.1 色谱条件  64-65
        4.2.2 线性关系  65
        4.2.3 专属性  65
        4.2.4 回收率  65
        4.2.5 精密度  65-66
        4.2.6 5-FU-Suc-Chi/NPs中药物包封率的测定  66
    5 5-FU-Suc-Chi/NPs制备单因素考察  66-70
      5.1 油相分散介质的选择  66-67
      5.2 处方因素的考察  67-68
        5.2.1 油相中Ethanol浓度的影响  67
        5.2.2 水相中Suc-Chi浓度的影响  67-68
        5.2.3 5-氟尿嘧啶浓度的影响  68
      5.3 工艺因素的考察  68-70
        5.3.1 搅拌速度的影响  68-69
        5.3.2 乳化温度的影响  69
        5.3.3 乳化时间的影响  69
        5.3.4 水分挥发时间的影响  69-70
        5.3.5 超声时间的影响  70
    6 正交设计制备5-FU-Suc-Chi/NPs  70-71
    7 5-FU-Suc-Chi/NPs最优处方的验证  71-72
  三 讨论与小结  72-73
    1 讨论  72-73
    2 小结  73
  参考文献  73-76
第四章 5-FU-Suc-Chi/NPs理化特征及体外释放  76-97
  一 材料与仪器  76
    1 材料  76
    2 仪器  76
  二 方法与结果  76-92
    1 5-FU-Suc-Chi/NPs的制备  76-77
    2 5-FU-Suc-Chi/NPs理化特征  77-80
      2.1 5-FU-Suc-Chi/NPs的外观形态  77-78
      2.2 5-FU-Suc-Chi/NPs的粒径  78-79
      2.3 Suc-Chi/NPs的zeta电位  79
      2.4 5-FU-Suc-Chi/NPs包封率与载药量的测定  79-80
    3 5-FU-Suc-Chi/NPs理化特征影响因素  80-81
      3.1 N-琥珀酰壳聚糖分子参数对纳米粒理化特征影响  80-81
        3.1.1 取代度DS对纳米粒理化特征影响  80
        3.1.2 分子量对纳米粒理化特征影响  80-81
      3.2 浓度对纳米粒理化特征影响  81
    4 5-FU-Suc—Chi/NPs稳定性  81-83
      4.1 5-FU-Suc-Chi/NPs稳定性的考察  81-82
      4.2 5-FU-Suc-Chi/NPs冻干粉针的制备  82-83
        4.2.1 支架剂的选择  82-83
        4.2.2 冻干粉针制备工艺  83
    5 5-FU-Suc-Chi/NPs外释药的研究  83-92
      5.1 5-FU-Suc-Chi/NPs体外释药方法  83-84
      5.2 药物体外释药模型的拟合  84-91
      5.3 PH对5-FU-Suc-Chi/NPs体外释药的影响  91
      5.4 浓度对5-FU-Suc-Chi/NPs体外释药的影响  91-92
  三 讨论与小结  92-95
    1 讨论  92-94
    2 小结  94-95
  参考文献  95-97
第五章 5-FU-Suc-Chi/NPs的体内组织分布及靶向性  97-122
  一 材料与仪器  97
    1 材料  97
    2 仪器  97
    3 细胞及动物  97
  二 方法与结果  97-117
    1 Suc—Chi/NPs体外靶向性研究  97-99
      1.1 Suc-Chi的荧光标记  98
      1.2 荧光标记的N-琥珀酰壳聚的纳米粒制备  98
      1.3 荧光标记的壳聚糖纳米粒制备  98-99
      1.4 流式细胞仪评价FITC-Suc—Chi/NPs与K562肿瘤细胞的亲和性  99
    2 FITC-Suc—Chi/NPs在荷瘤小鼠体内靶向性研究  99-104
      2.1 荷瘤小鼠动物模型的制作  99
      2.2 FITC-Suc-Chi/NPs体内分析方法的建立  99-101
        2.2.1 生物样品的处理  100
        2.2.2 标准曲线的建立  100
        2.2.3 精密度  100-101
        2.2.4 回收率  101
      2.3 FICT-Suc-Chi/NPs在荷瘤小鼠体内组织分布  101-104
        2.3.1 荧光显微镜下观察FICT-Suc-Chi/NPs在组织切片中蓄积量  102-103
        2.3.2 FICT-Suc-Chi/NPs在荷瘤小鼠体内组织分布  103-104
    3 5-FU-Suc-Chi/NPs在荷瘤小鼠体内靶向性研究  104-117
      3.1 5-FU内分析方法的建立  104-111
        3.1.1 色谱条件  104
        3.1.2 标准溶液和内标溶液的配制  104
        3.1.3 生物样品处理  104-105
        3.1.4 专属性  105-109
        3.1.5 标准曲线  109
        3.1.6 精密度  109
        3.1.7 回收率  109-111
      3.2 5-FU-Suc-Chi/NPs组织分布  111-116
      3.3 5-FU—Suc-Chi/NPs肿瘤靶向性评价  116-117
  三 讨论与小结  117-119
    1 讨论  117-119
    2 小结  119
  参考文献  119-122
第六章 5-FU-Suc-Chi/NPs的药动学及药效学  122-132
  一 材料与仪器  122
    1 材料  122
    2 仪器  122
    3 细胞及动物  122
  二 方法与结果  122-129
    1 5-FU-Suc-Chi/NPs在大鼠体内药动学研究  122-127
      1.1 5-FU在大鼠血浆中分析方法的建立  122-125
        1.1.1 色谱条件  122-123
        1.1.2 对照品溶液和内标溶液的配制  123
        1.1.3 血浆样品处理  123
        1.1.4 专属性  123
        1.1.5 标准曲线  123-124
        1.1.6 精密度  124
        1.1.7 回收率  124-125
      1.2 5-FU-Suc-Chi/NPs在大鼠体内的药代动力学研究  125-127
        1.2.1 大鼠体内的药代动力学研究方法  125-126
        1.2.2 非房室模型药动学参数的计算  126-127
        1.2.3 相对生物利用度  127
    2 5-FU-Suc-Chi/NPs在荷瘤小鼠体内药效学的研究  127-129
      2.1 药效学的研究的方法  127-128
      2.2 Sarcoma 180肿瘤抑制率的评价  128-129
      2.3 5-FU-Suc—Chi/NPs在荷瘤小鼠体内毒性的评价  129
  三 讨论与小结  129-131
    1 讨论  129-130
    2 小结  130-131
  参考文献  131-132
全文结论  132-134
创新点与展望  134-135
致谢  135

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