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发现与验证不同压力条件下鼠疫菌的非编码RNA

作　者: 曲奕
导　师: 杨瑞馥; 韩延平
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 鼠疫菌 sRNA cDNA文库 RNA组学
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景非编码RNA(ncRNA)作为基因组最大的一类转录产物,在生物的生长发育和适应环境改变的过程中发挥着不可替代的调控作用。细菌中发挥调节作用的非编码RNA,称为“调节小RNA”(sRNA)。鼠疫的病原菌--鼠疫菌鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)是多一种多宿主寄生菌,面对多宿主复杂的环境因素,鼠疫菌必须能够感应并快速适应每个环节的环境变化,才能最终在宿主体内存活和在自然界中传播并最终致病,而每个适应性反应也必然伴随着严格的基因转录调控。人们已经做了大量关于鼠疫菌的面临环境压力时的适应性调控工作,但大都集中在研究调控基因和蛋白质调控子上。而对于鼠疫菌的sRNA的研究,尤其是在面临复杂环境变化时的sRNA调控,研究工作几乎为空白。在早期的sRNA研究中,大多是采用计算机对基因组预测的方法发现新的ncRNA。但是由于ncRNA没有像mRNA那样的保守序列(ORF,起始和终止密码子,多聚腺苷酸化信号等),且一般较短,因此导致一维结构缺乏足够的统计信号,造成计算机软件预测ncRNA序列远比预测编码蛋白基因困难得多。随后人们采用传统cDNA文库构建的方法来发现新的ncRNA。通过这种方法,在很多物种中都发现了大量新的ncRNA。方法本研究是在鼠疫菌基因组测序完成的情况下,构建鼠疫菌50~400nt sRNA的cDNA文库,试图从整个基因组水平上获得更多新的、鼠疫菌特异的ncRNA,为其功能研究奠定基础。本研究旨在鉴定鼠疫菌传播感染过程中参与基因调控的sRNA分子,我们依据鼠疫菌在传播和感染过程中可能面临的环境,设计并实施了多个体外模拟刺激的条件,包括温度、生长时期、铁缺乏(模拟宿主体内低铁环境)、低钙(模拟感染初期III型分泌系统的形成环境)和低镁(模拟巨噬细胞中溶酶体环境)5种刺激因素,对5种条件的鼠疫菌总RNA进行提取,构建鼠疫菌的sRNA cDNA文库。我们发展了一系列先进的RNA目标片段筛选方法,并将能获得全长RNA序列的RACE技术结合到cDNA文库的构建工作中,因此我们的方法更易于获得真实的、全长的sRNA分子。cDNA文库的测序结果进行基因组定位、筛选等一系列深入分析,对得到的序列进行分类,每一类中挑选出有代表性的若干sRNA进行Northern Blot和RACE的实验,验证其完整性和真实存在性,并对文库中得到的70nt以上的sRNA进行Real-time PCR的定量分析。最后,通过RNA二级结构的预测软件Mfold对获得的对sRNA进行二级结构的预测。结果通过上述RNA组学的方法和每一步实验操作严格的质量监控,我们得到了鼠疫菌sRNA文库的2540个有效克隆。与鼠疫菌201株基因组进行比对和定位发现,81.73%的克隆为候选的非编码RNA,而tRNA和rRNA,分别仅占了2.32%和5.16%,证明了我们通过磁珠垂钓的方法对rRNA和干扰序列的去除得到了较理想的效果。通过进一步分析,我们共得到了52个、7类候选的sRNA分子,其中包括了5个(9.61%)已知的鼠疫菌sRNA和47个全新的非编码RNA(novel sRNA, nosRNA)。这52个sRNA分子除了两条的长度小于50nt外,其余都集中在50~400nt的范围之内,而且绝大多数来源于鼠疫菌的染色体。我们在每一类sRNA中挑选出具有代表性的sRNA进行定性和定量的深入分析。通过Northern Blot、定量PCR和RACE的实验结果证明,我们实验中得到的绝大多数sRNA都是真实存在的并且基本得到了全长,而且几乎所有的sRNA在5种条件下都是有表达并有部分表现出了明显的表达差异。此外,通过对相邻基因启动子的敲除实验,我们还证明了一类新的sRNA(UTR sRNA)是独立存在的。通过对sRNA进行了二级结构的分析,发现几乎所有的sRNA都包含茎-环的结构,且有些自由能较高。结论本研究所用的建库方法是可行的,cDNA文库相对来说比较完整,片段覆盖的范围较广,得到ncRNA在文库中所占的比例较大,获得新ncRNA的效率较高,并且得到的序列大都是真实可信的。尽管我们给出的鼠疫菌sRNA的信息还不全面,而且还有赖于后续研究的补充甚至更正,但仍然为鼠疫菌基因sRNA的发现及其调控网络的构建及基因功能的预测方面迈出了关键的一步。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
本研究中所使用的缩略语  10-11
前言  11-19
  1 鼠疫的危害  11-12
  2 鼠疫菌病原学和传播的研究概况  12-15
    2.1 鼠疫菌的生理生化特征  12-13
    2.2 鼠疫菌的传播和致病过程  13-14
    2.3 鼠疫菌传播中的环境压力研究概况  14-15
  3 非编码 RNA 的研究概况  15-18
    3.1 ncRNA 在生命活动中发挥至关重要的作用  15-16
    3.2 细菌中的 sRNA  16-17
    3.3 鼠疫菌中 sRNA 的研究现状  17-18
  4 研究目的和意义  18-19
第一章鼠疫菌非编码 RNA 的 cDNA 文库构建  19-53
  1 引言  19-20
  2 CDNA 文库的构建策略  20-21
  3 实验材料  21-25
    3.1 菌株和载体  21
    3.2 细菌培养基  21-24
    3.3 试剂与耗材  24-25
  4 实验方法  25-42
    4.1 细菌培养  25-26
    4.2 总 RNA 的提取及质量检测  26-28
    4.3 总 RNA 的片段分离  28-31
    4.4 去除 rRNA 和高峰度重复序列  31-34
    4.5 连接 3’和 5’接头  34-38
    4.6 逆转录  38-39
    4.7 定向克隆  39-42
  5 结果与讨论  42-52
    5.1 RNA 的质量监控  42-43
    5.2 cDNA 文库的构建  43-49
    5.3 cDNA 文库的测序结果及分析  49-52
  6 结论  52-53
第二章 SRNA 的验证  53-92
  1 引言  53-54
  2 实验方案  54-55
  3 实验材料与方法  55-67
    3.1 试剂与耗材  55
    3.2 制备 Northern Blot 探针  55-57
    3.3 Northern Blot 杂交验证  57-60
    3.4 Real‐time PCR  60-62
    3.5 3’RACE  62-64
    3.6 alkA 启动子缺失突变株的构建与分析  64-67
  4 结果与讨论  67-91
    4.1 Antisense sRNA(AS sRNA)  67-76
    4.2 基因间区 sRNA(IGR sRNA)  76-79
    4.3 possible IGR operon sRNA 的研究  79-80
    4.4 跨 2 个 ORF 的 sRNA  80-83
    4.5 Repetitive sRNA 的验证与研究  83-85
    4.6 UTR sRNA 的验证  85-88
    4.7 已知 sRNA 的分析  88-90
    4.8 RACE 实验结果  90
    4.9 鼠疫菌 sRNA 的二级结构分析  90-91
  5 结论  91-92
参考文献  92-97
文献综述  97-112
  参考文献  107-112
附录 1  112-123
附录 2  123-131
个人简历  131-132
致谢  132-133

发现与验证不同压力条件下鼠疫菌的非编码RNA

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