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示踪鼠疫菌构建及吞噬细胞对其吞噬能力的观察

作　者: 刘轶然
导　师: 王效义
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 示踪鼠疫菌吞噬作用吞噬细胞
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:鼠疫是一种严重威胁人类健康的自然疫源性传染病,主要经蚤叮咬而传播,亦可经呼吸道吸入而感染,传染性强,病死率高。而鼠疫耶尔森氏菌是引起鼠疫的病原体,鼠疫耶尔森氏菌的致病机制与宿主的免疫反应涉及到感染与免疫的两个方面。鼠疫菌通过偶然的机会(蚤类叮咬或人类剥食受感染的动物)进入机体后,首先被局部淋巴组织中的中性粒细胞和巨噬细胞吞噬,被中性粒细胞吞噬的鼠疫菌很快被杀灭,而被巨噬细胞吞噬的鼠疫菌可以在巨噬细胞中大量繁殖,并合成大量的毒力因子。当巨噬细胞崩解,鼠疫菌再次从巨噬细胞中释放到细胞外时,便具备了抵抗宿主免疫防御的能力,然后随淋巴液、血液流经其他局部淋巴组织或全身其他脏器中,引起腺鼠疫,肺鼠疫或败血症鼠疫等。目前对鼠疫菌感染引起宿主体液免疫反应的研究较深入,并发现了一些重要的保护性抗原,如:F1(荚膜抗原)和LcrV(V-抗原)等;然而,越来越多的证据显示细胞免疫在宿主抵抗鼠疫菌的机制中发挥了更加重要的作用,例如,将鼠疫菌活化的T细胞输入小鼠后能有效保护吸入性鼠疫菌的感染,也有证据证实巨噬细胞和中性粒细胞可以有效地吞噬强毒鼠疫菌,但减毒鼠疫菌免疫动物后,巨噬细胞和树突细胞吞噬减毒鼠疫菌的能力和抗原提呈的机制至今尚未阐明。本研究将表达绿色荧光蛋白的原核表达质粒和表达红色荧光蛋白的真核表达质粒导入到鼠疫菌EV76疫苗株和缺失了所有毒力质粒的鼠疫菌201株中,构建成示踪鼠疫菌,拟通过观察巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞对它们的吞噬能力和细胞对鼠疫菌的杀灭能力,为研究宿主免疫反应机制奠定基础。方法:我们将目的片段F1和V以及真核质粒pIRES2 DsRed-Express2经内切酶Bgl II和EcoRI酶切后相连,筛选成功连接,同时目的片段经测序证实无突变的单克隆菌落。提取质粒后,使用鼠疫菌201株质粒缺失株(201P-)和EV76疫苗株作为质粒载体,携带两种类型的质粒(即表达绿色荧光蛋白的原核质粒pBC-GFP和表达红色荧光蛋白的真核质粒pIRES2 DsRed-Express2),其表达不同颜色的荧光蛋白作为鼠疫菌进入机体示踪的手段,利用磁珠分离技术从脾细胞中分离出中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞,利用流式细胞仪检测细胞含荧光蛋白的鼠疫菌比例,来观察三种细胞吞噬鼠疫菌的情况以及三种细胞杀灭鼠疫菌的能力等等。基于本实验主要目的是探究吞噬细胞对鼠疫菌吞噬能力的观察,以及吞噬能力是否与毒力相关等方面,所以我们动物实验只观察了两株菌EV76(pIRES2 DsRed-Express2+pBC-GFP)和201P-(pIRES2 DsRed-Express2-F1 +pBC-GFP),而201P-(pIRES2 DsRed-Express2-V+pBC-GFP)只进行了体外实验,没有再进行动物实验。我们主要通过两株菌携带不同的质粒分别感染两组小鼠来观察吞噬细胞的吞噬情况: EV76(pIRES2 DsRed-Express2+pBC-GFP)和201P-(pIRES2 DsRed-Express2-F1+pBC-GFP),在观察几种细胞吞噬鼠疫菌能力差异的同时,观察田鼠型鼠疫菌201株在质粒完全缺失的情况下作为鼠疫菌DNA疫苗的载体,通过酶联免疫法测定小鼠血清抗体,探讨鼠疫菌201P-作为鼠疫菌DNA疫苗载体的可行性。结果:本实验成功将表达鼠疫菌两个重要保护性抗原的F1和V片段分别克隆到真核表达质粒pIRES2 DsRed-Express2中,经过转染293细胞实验证实插入F1和V片段的真核质粒可以正常表达,将细胞表达的融合蛋白从细胞中释放出来通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-Blot蛋白免疫活性鉴定,结果表明融合蛋白F1和V的免疫原性良好,同时用鼠疫菌感染体外培养的巨噬细胞RAW,分别将细胞内外的鼠疫菌和细胞核染色,通过共聚焦显微镜成功观察巨噬细胞有效地吞噬鼠疫菌,随后用导入两种质粒的鼠疫菌EV76(pIRES2 DsRed-Express2+pBC-GFP)和201P-(pIRES2 DsRed-Express2-F1+pBC-GFP)免疫小鼠,不同时间点处死小鼠后,经过磁珠分离后的巨噬细胞,中性粒细胞,树突细胞经流式细胞仪检测,初步证实24h分离的中性粒细胞中残留有微量的鼠疫菌,而在巨噬细胞和树突细胞内鼠疫菌可以存活,并且流式细胞仪可以检测到表达红色荧光的巨噬细胞和树突细胞。ELISA检测结果显示EV76和201P-(含pIRES2 DsRed-Express2-F1)第一次免疫后均有抗体效价,且相差不大;但第二次加强免疫10天后检测,EV76免疫组抗体滴度明显高于201P-免疫组,而且这两次的检测结果经统计学分析,都具有显著性差异,具有统计学意义。结论:我们设计用两种质粒表达不同的颜色来追踪鼠疫菌进入机体后与吞噬细胞的相互作用,鼠疫菌在存活状态下可以正常表达PBC-GFP原核质粒表达绿色荧光蛋白,使我们可以追踪到鼠疫菌;当鼠疫菌被细胞吞噬并降解掉以后,此时原核质粒在真核环境中不再表达,而真核质粒pIRES2 DsRed-Express2在真核环境中开始表达红色荧光蛋白,有利于我们分析各吞噬细胞吞噬鼠疫菌的能力。本实验将双色质粒导入到鼠疫菌201质粒缺失突变株和EV76疫苗株后,免疫小鼠,对鼠疫菌进入机体后吞噬细胞(包括:中性粒细胞,巨噬细胞和树突细胞)对其吞噬能力以及鼠疫菌的存活情况做了初步评价,在24h中性粒细胞中检测到微量的绿色荧光蛋白,在树突细胞和巨噬细胞中可以检测到相对较多的绿色荧光蛋白,而且EV76株组比201P-组的数量也相对多一些。而且在随后的72h或96h可以检测到表达红色荧光蛋白的巨噬细胞和树突细胞,而且EV组阳性细胞的数量也高于201P-组,初步证明不同吞噬细胞针对鼠疫菌的吞噬能力差异;鼠疫菌的毒力与吞噬细胞的吞噬能力有关;同时我们通过ELISA检测两组小鼠F1抗体的产生情况,通过结果可以看出201P-组同样可以产生F1抗体,虽然两次检测抗体滴度均低于EV76组,但可以证实鼠疫菌201株质粒缺失突变株作为DNA疫苗的载体携带DNA疫苗的可行性。

全文目录

缩略词表  6-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-12
前言  12-19
  1. 鼠疫菌的流行与概况  12-13
  2. 鼠疫的致病机制  13-15
  3. 宿主免疫  15
  4. 鼠疫疫苗的研究  15-16
  5. 本实验的目的和意义  16-18
  6. 实验流程  18-19
1. 实验材料  19
  1.1 实验菌株及主要材料  19
  1.2 实验所用主要试剂  19
2. 实验方法  19-29
  2.1 重组质粒的构建  19-22
    2.1.1 引物设计与扩增目的片段  19-20
    2.1.2 目的片段和质粒酶切  20-21
    2.1.3 载体与目的基因的连接  21
    2.1.4 连接体系转化感受态细胞  21
    2.1.5 阳性克隆的增菌与筛选鉴定  21-22
  2.2 细胞复苏  22-23
    2.2.1 HEK293 细胞复苏  22
    2.2.2 HEK293 传代  22
    2.2.3 细胞铺板前计数  22
    2.2.4 转染HEK293 细胞  22-23
  2.3 融合蛋白免疫原性测定  23-24
    2.3.1 细胞裂解  23
    2.3.2 SDS-PAGE 蛋白电泳  23
    2.3.3 Western blot  23-24
  2.4 共聚焦检测巨噬细胞RAW 吞噬  24-25
    2.4.1 增菌  24
    2.4.2 巨噬细胞RAW 铺板  24
    2.4.3 细胞吞噬实验  24-25
  2.5 双质粒电转化进入EV76 和201P-  25-26
    2.5.1 真核质粒pIRE52 DsRed-Expre552 转入EV76  25
    2.5.2 重组真核质粒转入201P-  25
    2.5.3 再次电转表达绿色荧光蛋白的原核质粒PBC-GFP  25-26
  2.6 动物实验  26-29
    2.6.1 准备工作  26
    2.6.2 菌落计数  26
    2.6.3 免疫小鼠  26
    2.6.4 提取脾脏和腹腔巨噬细胞  26-29
      2.6.4.1 提取腹腔内的巨噬细胞  27
      2.6.4.2 脾脏处理  27-28
        2.6.4.2.1 分离中性粒细胞  27
        2.6.4.2.2 分离巨噬细胞  27-28
        2.6.4.2.3 分离树突细胞  28
      2.6.4.3 酶联免疫法检测小鼠体内抗体  28-29
3. 结果与讨论  29-48
  3.1 重组质粒转染293 细胞  29-30
  3.2 WESTERN BLOT 鉴定目的蛋白  30-31
  3.3 细胞吞噬实验  31-32
  3.4 原核质粒表达  32-33
  3.5 流式细胞仪检测结果  33-46
  3.6 酶联免疫法检测免疫小鼠抗体的结果  46-48
综述  48-54
参考文献  54-57
附录  57-73
  实验所用主要仪器  57-58
  实验所用试剂配制方法  58-71
  硕士期间完成的其他工作  71-72
  硕士期间发表的论文  72-73
个人简历  73-74
致谢  74-75

示踪鼠疫菌构建及吞噬细胞对其吞噬能力的观察

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