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大叶藻全长cDNA文库构建及表达序列标签分析

作　者: 刘利民
导　师: 茅云翔；孔凡娜
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 大叶藻全长cDNA文库表达序列标签抗逆基因金属硫蛋白捕光蛋白
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

大叶藻(Zostera marina L.)是重要的沉水盐生植物,属于沼生目(Helobieae)、眼子菜科(Potamogetonaceae)、大叶藻属(Zostera),是一种常见的海草。为发掘大叶藻抗逆基因、探索其抗逆机制,本实验采用SMART(Switching mechanism at 5’end of RNA transcript method)方法构建了大叶藻在不同盐度下的全长cDNA文库,并对文库中的部分单克隆进行了5’末端测序和生物信息学分析,为进一步开展抗逆相关基因的克隆鉴定工作奠定了基础。以三种不同盐度处理的大叶藻混合mRNA为模板合成cDNA,构建了叶片组织全长cDNA文库。原始文库滴度为8.675×10~6pfu/mL,重组率为97.19%,扩增后的文库滴度达到1.03×10~9pfu/mL;插入片段集中在750-2000bp范围,平均长度大于800bp。随机挑取4081条单克隆进行5’末端测序,获得了3986条有效EST,被组装成145条contigs和1790条singletons,总计1935条unigene。在GenBank dbEST数据库中的注册号为HS089944–HS091857、JG698933- JG699246。通过对序列表达丰度分析发现,metallothionein和chlorophyll a/b-binding protein基因家族的表达丰度最高,分别占总EST的10.2%和1.9%。生物信息学分析表明,1427条unigene在BlastX比对中得到注释,仍然有37.5%的基因未得到注释,说明本次测序得到了大量的未知功能的新基因;COG分析452个基因被分类到22个亚类中;KEGG表明525个基因被分配到241个代谢途径中,其中包括一条近似完整的C3/C4/CAM代谢途径;574个基因得到了740个GO术语;InterProScan分析产生个982个InterPro家族。该文库的构建和EST序列的分析将为进一步了解大叶藻抗逆基因的功能提供有效的信息。对文库中表达丰度较高的metallothionein和chlorophyll a/b-binding protein基因家族进行了生物信息学分析。发现了12个编码捕光蛋白的基因序列,命名为Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca5、Lhca6、Lhcb1.1、Lhcb1.2、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6,分属于光系统Ⅰ中的Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca5、Lhca6以及光系统Ⅱ的Lhcb1、Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、Lhcb6类基因家族。蛋白功能结构域预测分析,该12个编码蛋白质都含有捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域和多个功能位点,通过对5个Lhcb的相似性比较发现Lhcb1.1和Lhcb2之间的相似性较高为75%。系统进化树分析表明大叶藻部分Lhc在分类上表现出与双子叶植物更近的亲缘关系。发现3个编码金属硫蛋白的基因,将其命名为Mtlp-Zm2.1、Mtlp-Zm2.2和Mtlp-Zm3,前两者属于2型金属硫蛋白,Mtlp-Zm3属于3型金属硫蛋白。对Mtlp-Zm2.1和Mtlp-Zm2.2两个基因进行序列分析发现,Mtlp-Zm2.1编码62个氨基酸残基的多肽,其分子量为6.3KD,等电点为4.65,其中含有8个半胱氨酸残基,占总氨基酸的12.9%;Mtlp-Zm2.2编码82个氨基酸残基的多肽,其分子量为8.2KD,等电点为5.18,其中含有14个半胱氨酸残基,占总氨基酸的17.1%。系统进化树分析表明大叶藻Mtlp-Zm2.2与沉水盐生植物具有较近的亲缘关系,进化地位早于陆生植物与淡水生植物的2型金属硫蛋白的编码基因。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
0. 文献综述  12-27
  0.1 大叶藻简介  12-14
  0.2 植物抗逆机理研究  14-16
    0.2.1 渗透调节  14-15
    0.2.2 ROS 清除机制  15
    0.2.3 信号转导  15-16
    0.2.4 大分子蛋白调节  16
    0.2.5 光合作用调节  16
  0.3 大叶藻耐盐机理的研究  16-18
    0.3.1 大叶藻形态学特征  16-17
    0.3.2 大叶藻耐盐机理的研究  17-18
  0.4 全长cDNA 文库的构建  18-19
    0.4.1 全长cDNA 文库的构建方法  18
    0.4.2 SMRAT 技术  18-19
  0.5 捕光蛋白研究进展  19-23
    0.5.1 LHCⅠ  20-21
    0.5.2 LHCⅡ  21-23
  0.6 金属硫蛋白研究进展  23-25
    0.6.1 金属硫蛋白分类  23-25
    0.6.2 金属硫蛋白功能  25
  0.7 本研究的目的和意义  25-27
1. 材料  27-30
  1.1 实验材料  27
  1.2 菌种和主要试剂  27-28
  1.3 主要仪器设备  28-29
  1.4 cDNA 文库构建所涉及的引物  29-30
2. 方法  30-36
  2.1 样品处理  30
  2.2 文库的构建  30-34
    2.2.1 总RNA 的提取  30-31
    2.2.2 mRNA 的纯化  31
    2.2.3 双链cDNA 的合成  31-33
    2.2.4 蛋白酶K 消化及SfiⅠ酶切  33
    2.2.5 cDNA 的分级分离  33-34
    2.2.6 载体的连接与噬菌体文库的构建  34
    2.2.7 质粒文库的转化  34
  2.3 表达序列标签分析  34-36
    2.3.1 EST 测序  34
    2.3.2 生物信息学分析  34-35
    2.3.3 重要基因cDNA 及及氨基酸序列分析  35-36
3. 结果  36-69
  3.1 总RNA 的提取及m RNA 的纯化  36
  3.2 ds cDNA 合成和cDNA 分级分离  36-37
  3.3 文库构建及质量检测  37-38
  3.4 cDNA 文库转化  38-39
  3.5 序列表达标签分析  39-47
    3.5.1 ESTs 数据分析  39-41
    3.5.2 同源性比对结果  41-42
    3.5.3 KEGG 分析  42-43
    3.5.4 COG 分析  43-44
    3.5.5 GO注释和Interopro  44-47
  3.6 抗逆相关基因的筛选  47-56
  3.7 碳代谢相关基因  56-58
  3.8 Lhc 基因家族序列分析  58-66
    3.8.1 Lhca 序列特征分析  59-60
    3.8.2 Lhcb 的序列特征分析  60-62
    3.8.3 系统树构建  62-66
  3.9 金属硫蛋白基因家族序列分析  66-69
    3.9.1 序列特征分析  66-67
    3.9.2 系统树构建  67-69
4. 讨论  69-78
  4.1 文库构建  69-70
    4.1.1 RNA 提取  69
    4.1.2 二链cDNA 的合成  69
    4.1.3 文库构建的意义  69-70
  4.2 ESTs 序列分析  70-71
  4.3 光合作用调节  71-74
    4.3.1 大叶藻光合作用特点  71-72
    4.3.2 大叶藻捕光蛋白家族  72-74
  4.4 ROS 清除系统  74-75
  4.5 渗透调节机制及相关基因  75-76
  4.6 其他抗逆机制及相关基因  76-78
参考文献  78-89
致谢  89-90
个人简历  90
发表的学术论文与研究成果  90

大叶藻全长cDNA文库构建及表达序列标签分析

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